广谱抗稻瘟病基因Pi9的应用和进化研究

论文摘要

本研究系统地探讨了农杆菌介导籼稻遗传转化的主要影响因素，建立了稳定、高效的农杆菌介导籼稻的转化体系。通过农杆菌介导法，将广谱抗稻瘟病基因Pi9转入8个籼稻品种（丰源B，湘晚籼11号，湘晚籼13号，R996，527，1701，25H003，25H075）和粳稻品种日本晴的愈伤组织中，得到了转Pi9基因的株系，并对T1代和T2代转基因植株进行了GUS、PCR和RT-PCR检测以及T2代植株的稻瘟病抗性鉴定。同时，对3个野生稻中的Pi2／9位点进行了进化分析。本研究主要结果如下：1 pc1301-Pi9质粒的鉴定将大肠杆菌和农杆菌中提取的质粒pc1301-Pi9分别用限制性内切酶SalⅠ和KpnⅠ酶切，电泳分析表明质粒pc1301-Pi9可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定遗传。2高效转化体系的建立和Pi9基因对籼稻的转化研究（1）不同培养基对籼稻愈伤组织诱导的影响将8个籼稻品种的成熟种子分别接种子NB、N6、MS、CC和L3培养基上，结果表明，NB、N6、MS、CC和L3这5种培养基诱导籼稻的平均出愈率分别为：81.7％、75.4％、68.0％、58.5％和55.5％。因此，NB培养基最适于诱导籼稻胚性愈伤组织。（2） ABA对愈伤组织诱导的影响ABA对某些品种愈伤组织的诱导具改善作用，可减少褐化死亡现象。（3）愈伤组织的继代分析比较了L3和NB两种培养基对愈伤组织继代效果，发现L3更适于愈伤组织继代。愈伤组织继代8d、15d、25d的分析表明，愈伤组织宜选择继代15d左右做共培养较好，这时愈伤组织大而嫩黄且生命力强。（4）共培养时间对转化的影响以1701为受体，共培养时间为1d、2d、3d、4d，获得的抗性愈伤率分别为32.6％、68.2％、75.5％和60.0％。因此，共培养时间为3d的转化效果最好，获得的抗性愈伤率最高，达75.5％。（5）不同菌液浓度对愈伤组织转化的影响用OD值为0.5、1.0、1.5、2.0的菌液浓度与1701的愈伤组织进行共培养，获得的抗性愈伤率分别为64.1％、74.7％、62.1％和51.0％。因此，OD值为1.0菌液浓度更适于籼稻愈伤组织的转化。（6）乙酰丁香酮对转化的影响共培养中加入200μmol／L的乙酰丁香酮可获得的较高的抗性愈伤率，为75.3％。在菌液、共培养培养基以及同时在菌液和共培养培养基中加入乙酰丁香酮，获得1701的抗性愈伤率分别为59.8％、68.3％和75.7％。表明菌液和共培养培养基同时加入乙酰丁香酮，转化效果较好。（7）筛选压力的确定40mg／L的潮霉素B浓度适用于籼稻抗性愈伤组织的筛选；20mg／L的潮霉素B浓度用于生根培养基中幼苗的筛选。（8）抗性愈伤组织的筛选情况愈伤组织经S40培养基筛选后，日本晴的抗性愈伤率达89.9％。籼稻的抗性愈伤率在69.4％～82.5％之间，其中R996为69.4％，25H003为82.5％。（9） 9个品种的转化情况本研究日本晴的转化率是63.3％，籼稻品种阳性苗的转化率在3.2％～25.9％之间，其中25H075最低为3.2％，R996最高达25.9％。（10）不同激素配比对愈伤组织分化率的影响6-BA 2mg／L+KT 2mg／L+NAA 0.5mg／L+IAA 0.5mg／L的激素配比适于抗性愈伤组织的分化。3 GUS、PCR和RT-PCR检测及稻瘟病抗性鉴定对获得的T1代和T2代植株经GUS、PCR和RT-PCR检测以及T2代植株的稻瘟病抗性鉴定，表明Pi9基因已整合到受体基因组中，并遗传给子代，在子代中稳定表达。4 Pi2／9位点的进化分析对3个野生稻中的Pi2／9位点NBS-LRR基因与Pi2和Pi9位点NBS-LRR基因进行序列比较分析，表明除假基因外的所有这些NBS-LRR基因属于相同的进化树，有共同的祖先，并且大多数NBS-LRR基因都有一个高度保守的内含子。这一研究为稻瘟病抗性基因的进化分析奠定了基础，并为植物中广谱抗性分子机理的阐明提供了线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 稻瘟病研究进展
• 1.1 稻瘟病菌遗传的多样性
• 1.2 稻瘟病菌致病机理的研究
• 1.3 寄主和病原物相互作用的分子基础
• 1.4 稻瘟病抗性基因的定位和克隆
• 1.5 展望
• 2 农杆菌介导法及其在水稻基因工程中的应用
• 2.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机理
• 2.2 农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素
• 2.2.1 水稻基因型
• 2.2.2 菌株和载体
• 2.2.3 转化受体
• 2.2.4 酚类物质
• 2.2.5 选择标记基因
• 2.2.6 启动子
• 2.2.7 培养基和共培养
• 2.2.8 报告基因
• 2.3 农杆菌转化系统的优缺点
• 2.4 农杆菌介导法在水稻遗传改良上的应用
• 2.4.1 抗虫性改良
• 2.4.2 抗病性改良
• 2.4.3 抗除草剂
• 2.4.4 抗逆基因工程应用
• 2.4.5 品质改良应用
• 2.4.6 提高水稻产量的应用
• 3 转基因植株的分子检测
• 3.1 报告基因的酶法检测
• 3.2 RT-PCR检测
• 3.3 PCR检测
• 3.4 Southern杂交
• 3.5 Northern杂交
• 3.6 Western杂交
• 4 研究内容和目标
• 4.1 研究内容
• 4.2 目标
• 第二章 籼稻高效遗传转化体系的建立与Pi9因的转化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 试剂和溶液
• 1.3.1 酶等试剂
• 1.3.2 质粒提取液
• 1.3.3 琼脂糖凝胶电泳溶液
• 1.4 培养基
• 1.5 质粒DNA的小量提取（碱裂解法）
• 1.6 质粒的鉴定
• 1.7 农杆菌感受态的制备
• 1.8 工程农杆菌的制备
• 1.9 Pi9基因对籼稻转化的基本技术路线
• 1.9.1 愈伤组织诱导及继代
• 1.9.2 工程农杆菌与水稻愈伤组织的共培养
• 1.9.3 抗性愈伤组织的筛选和幼苗分化
• 1.9.4 壮苗、驯化及移栽
• 1.10 调查指标
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒pc1301-Pi9的鉴定
• 2.2 不同培养基对籼稻愈伤组织诱导的影响
• 2.3 ABA对愈伤组织诱导的影响
• 2.4 愈伤组织在NB和L3培养基中的继代比较
• 2.5 不同品种愈伤组织在L3中的继代分析
• 2.6 共培养各因素对转化的影响
• 2.6.1 乙酰丁香酮（AS）对转化的影响
• 2.6.2 共培养时间对转化的影响
• 2.6.3 不同菌液浓度对愈伤组织转化的影响
• 40中的筛选'>2.7 不同品种愈伤组织在S₄₀中的筛选
• 2.8 抗性愈伤组织的分化与植株再生
• 2.9 不同激素配比对愈伤组织分化率的影响
• 2.10 优化的转化体系
• 3 小结与讨论
• 3.1 NB培养基适于籼稻的诱导
• 3.2 品种间的遗传转化差异
• 3.3 愈伤组织继代对转化的影响
• 3.4 共培养对转化的影响
• 3.5 抗性愈伤组织继代对转化的影响
• 3.6 预分化对籼稻转化的影响
• 3.7 分化对出苗率的影响
• 3.8 潮霉素B在转化中的作用
• 3.9 建立了农杆菌介导的高效籼稻转化体系
• 第三章 转Pi9基因水稻植株的分子检测及稻瘟病抗性鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 水稻材料
• 1.2 菌种
• 1.3 试剂及溶液
• 1.3.1 酶等试剂
• 1.3.2 GUS组织化学染色液
• 1.3.3 DNA提取液
• 1.4 培养基
• 1.5 水稻DNA的提取
• 1.5.1 水稻DNA大量提取
• 1.5.2 水稻DNA微量提取
• 1.6 水稻RNA提取（Trizol试剂法）
• 1.7 GUS活性测定
• 1.8 PCR检测
• 1.8.1 PCR反应体系（总体积20ul）
• 1.8.2 PCR反应程序
• 1.9 RT-PCR检测
• 1.9.1 RT-PCR反应体系（总体积25ul）
• 1.9.2 RT-PCR反应程序
• 1.10 T2代转基因苗的稻瘟病抗性鉴定
• 1.10.1 接种孢子的准备
• 1.10.2 T2代植株的抗性鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 T1代植株的生化和分子检测
• 2.1.1 报告基因表达检测
• 2.1.2 T1代植株的PCR检测
• 2.1.3 T1代植株的RT-PCR检测
• 2.2 T2代植株遗传性鉴定
• 2.2.1 GUS活性检测
• 2.2.2 T2代植株的PCR检测
• 2.2.3 T2代植株的RT-PCR检测
• 2.3 T2代植株的稻瘟病抗性鉴定
• 2.3.1 致病稻瘟病菌小种的筛选
• 2.3.2 T2代植株的稻瘟病抗性鉴定
• 3 结论和讨论
• 第四章 Pi2/9位点的进化分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 基因测序及序列比较分析
• 1.3 序列进化分析及系统进化树绘制
• 2 结果与分析
• 2.1 Pi2/9位点的序列分析
• 2.2 大多数Pi2/9位点NBS-LRR基因在N端都有一个二相内含子
• 2.3 Pi2/9位点NBS-LRR基因属于同一进化树
• 3 结论与讨论
• 第五章 结论与创新
• 1 结论
• 2 创新
• 参考文献
• 附录A:45A15的NBS序列
• 附录B:30A22的NBS序列
• 附录C:34K08的NBS序列
• 附录D:CC的NBS序列
• 附录E:本文略缩词表
• 致谢
• 作者简介