论文摘要
PA28是一种蛋白酶体调节蛋白,它能结合到20S蛋白酶体的外环并促进小肽的降解,这个过程并不需要蛋白的泛素化也不需要消耗ATP,这与PA700不同,后者是一种能识别并降解泛素化蛋白的大分子复合物。目前已经有证据证明,PA28-20S蛋白酶体也能够降解完整的蛋白分子,如HCV-core和SRC-3。这说明PA28-20S蛋白酶体能参与重要的细胞调节过程。PA28γ是PA28三种同系物中最保守的一种,而且PA28γ主要定位在细胞核中,这与其他两种同系物（PA28α和PA28β）主要定位在细胞质中不同,这可以认为PA28γ与其他两种同系物相比存在着很不同的生理功能。Nikaido等人的研究认为,PA28γ的表达可能与细胞的转化和细胞的生长调节相关,他们在研究该蛋白时发现,当A31细胞被诱导分裂时PA28γ的表达量上升了10倍。Murata等人通过敲除小鼠的PA28γ基因发现,基因敲除小鼠并没有什么明显的生理损伤,但是小鼠的生长速度要比正常小鼠慢,而且体型也没有正常小鼠大,另外,通过培养这种基因敲除的小鼠的胚胎成纤维细胞发现,敲除PA28γ基因后的胚胎成纤维细胞的生长速度下降,细胞的饱和密度下降,而且还会阻止细胞周期进入S期。相似地,P.Masson等人使用RNA干扰技术抑制了果蝇细胞PA28γ的表达后发现,被抑制后的果蝇细胞部分停留在了G1期。另外有报道,PA28γ能与PCNA（proliferating cell nuclear antigen）形成复合物,而且,PA28γ高表达在快速分裂的甲状腺癌细胞中并且核定位明显,这些研究都表明,PA28γ与细胞的DNA合成以及细胞的分裂存在着一定的关系。一些实验室在对肿瘤凋亡蛋白相互作用蛋白筛选时发现B-Raf、MEKK3、FLASH（CASP8-assosiated protein 2）、Daxx、RanBPM、PIASI等细胞凋亡相关因子均能与PA28γ相互作用,而Li研究组在研究乳腺癌细胞时首次发现并证明PA28γ能与癌基因SRC-3相互作用并在体内、体外降解这种完整的内源性蛋白（Cell,2006）。随后的研究又发现了几个重要的PA28γ相互作用蛋白,包括P21、P16、P19。然而,这些学者在相应的细胞株中高表达PA28γ,对目标细胞的周期和生长没有多大影响。考虑到以上报道的PA28γ相互作用蛋白都是与肿瘤的促进和抑制相关,我们可以认为,PA28γ可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要的双向调节作用。然而,它如何通过调节这么多重要的癌相关基因,从而在肿瘤的发生中发挥作用的,目前还没有明确的研究数据。总的来说,对于PA28γ在细胞中的生理功能目前还是模糊的。鉴于很多重要的癌基因在肿瘤的发生过程中会发生重要的突变,于是我们考虑PA28γ在癌细胞中的基因是否也会发生重要的突变,从本科室保存的18种正常细胞株和癌细胞株中克隆全长的PA28γcDNA,测序结果显示,PA28γ在这些细胞株（正常的和癌的）中并没有发生突变。考虑到PA28γ是一种核定位蛋白（这不同于其同系物PA28α、PA28β定位在胞浆）,但在细胞有丝分裂期（M期）能弥漫表达于整个细胞。我们推测:PA28γ的不同亚细胞定位对细胞不同时期有着不同的影响,与PA28γ对上述重要相互作用蛋白的精细调控密切相关,PA28γ通过这种在不同的细胞空间调控不同的蛋白或被不同的蛋白修饰,精细地调控这细胞的生理过程。因此,此次研究从构建PA28γ的基因突变体入手,从人胚肾细胞株（293T）中扩增并克隆出PA28γcDNA全长序列（自编号KL03-3）,将PA28γcDNA克隆至pMD18-T克隆载体,在这基础上,对PA28γcDNA序列进行定点突变和截断,构建了KL03-15（无NLS位点）和KL03-17（无NLS和蛋白酶体结合位点）等突变体,把KL03-3、KL03-15和KL03-17分别克隆到pCDNA3.1（-）Flag哺乳动物表达载体和pDsRed-C3荧光融合表达载体中,KL03-3还克隆到pEGFP-C2绿色荧光融合表达载体中。把鉴定正确的pcDNA3.1（-）KL03-3、pcDNA3.1（-）KL03-15、pcDNA3.1（-）KL03-17分别转染到人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株Chang,并且通过压力筛选和Western Blot鉴定,构建了以上两种重组阳性表达细胞系。细胞增殖实验显示,表达KL03-3和KL03-15能促进HepG2的增殖,KL03-15比KL03-3要稍明显,而空载体、pRed和KL03-17均无促进HepG2增殖的现象。而在另一方面,表达KL03-15和KL03-17能抑制Chang的增殖,KL03-15比KL03-17要明显,但在培养传代2月后,KL03-17无此现象,KL03-15的抑制现象也减缓,而空载体、pRed和KL03-3均无抑制Chang增殖的现象。瞬时转染的流式细胞术检测结果显示:转染HepG2并培养48h,KL03-3和KL03-15进入S期的细胞比例要大于KL03-17和空载体;而转染Chang时,kL03-3进入S期的细胞明显大于转染了KL03-15、KL03-17和空载体的细胞,且KL03-15进入S期的细胞比例稍少于KL03-17。通过细胞增殖实验和流式细胞术的周期检测实验可以得知,KL03-3（全长PA28γ）能促进肝癌细胞HepG2和正常肝细胞Chang的增殖,KL03-15（胞浆定位PA28γ）同样能促进肝癌细胞HepG2的增殖,但它却抑制正常肝细胞Chang的增殖,而KL03-17（胞浆定位PA28γ且缺乏蛋白酶体结合位点）,对肝癌细胞HepG2的增殖促进不明显,对正常肝细胞有一定的抑制,但作用不明显。以上结果表明,我们已经成功地构建了pcDNA3.1（-）KL03-3、pcDNA3.1（-）KL03-15、pcDNA3.1（-）KL03-17重组真核表达质粒和pDsRedl-C3KL03-3、KL03-15、KL03-17真核重组表达质粒,并构建了HepG2/KL03-3、HepG2/KL03-15、HepG2/KL03-17和Chang/KL03-3、Chang/KL03-15、Chang/KL03-17表达细胞系。而且,初步的研究发现,对于肝癌细胞HepG2,全长PA28γ（KL03-3）和胞浆定位的PA28γ（KL03-15）都能促进其增殖,而对于正常肝细胞Chang,全长PA28γ（KL03-3）能稍微促进其增殖,但胞浆定位的PA28γ（KL03-15）却是抑制其增殖。由此可见,胞浆定位的PA28γ对肝癌细胞和正常细胞的生长都起到重要的作用,它可能在癌细胞和正常细胞中通过不同的修饰或降解不同的蛋白发生不同的作用。目前,国内外尚未见关于该蛋白的胞浆表达对正常细胞和癌细胞会产生不同调节的报导。我们目前的研究结果为进一步阐明该蛋白的确切功能,以及它在人类肿瘤的发生、发展中所起的作用奠定了基础。
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