FAD8基因遗传转化小油桐提高幼苗抗寒性研究

论文摘要

小油桐（Jatropha curcas L.）属大戟科（Euphobiaceae）落叶灌木或小乔木。其种仁含油量高,干果产量大,油脂组成符合生物柴油油脂标准,是生物柴油的理想原料。但其生长易受低温和干旱伤害。因此,研究以生物技术改良其脂肪酸组成、提高抗寒性具有重要意义。拟南芥脂肪酸脱饱和酶FAD8基因编码ω-3脂肪酸脱饱和酶（ω-3fad）,催化以二烯酸底物脱饱和形成三烯酸,可增加小油桐植株不饱和脂肪酸含量,在低温下其表达量提高,可提高膜脂的流动性,增加植物的抗寒能力。本研究建立了小油桐高效遗传转化体系,利用本实验室克隆的拟南芥FAD8基因构建表达载体遗传转化小油桐,鉴定并筛选转基因小油桐植株,研究了FAD8基因脂肪酸代谢和抗寒性的影响。获得结果如下:1、小油桐高效再生体系的建立去壳消毒小油桐种子,沿纵轴切开胚乳,挑出幼胚接种于MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L的萌发培养基中培养无菌苗。以15天苗龄的无菌苗为外植体,子叶最佳分化培养基为MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L,分化率为82.9%;下胚轴最佳分化培养基为MS+6-BA2mg/L+IBA 0.2mg/L,分化率为23.8%;子叶柄最佳再生培养基为MS+6-BA 3mg/L+IBA0.1mg/L,分化率为32.7%。在小油桐再生培养基中添加1.0mg/L的AgNO3能促进小油桐植株再生,并抑制褐化。将小油桐再生芽苗接种于WPM培养基中生根,生根率为29.6%。本研究中,小油桐各外植体再生率均高于以往报道,首次以子叶柄获得再生苗。2、农杆菌介导小油桐遗传转化体系建立采用农杆菌介导法将FAD8基因（载体为pSH-FAD8）遗传转化小油桐:以15天苗龄的小油桐无菌苗的下胚轴、子叶、子叶柄为外植体,置于含200μg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液中进行侵染,子叶、子叶柄侵染8min,下胚轴侵染10min,28℃暗室中共培养3天后置含头孢霉素100mg/L的MS+6-BA3mg/L+IBA0.5mg/L培养基中脱菌生长5天,再接种至筛选培养基中培养,筛选条件是子叶和子叶柄利用卡那霉素30mg/L筛选;下胚轴以卡那霉素50mg/L筛选。将以GUS染色检测出的阳性植株进行PCR、RT-PCR检测,确定转基因小油桐植株27棵。与以往报道相比,本研究中建立的遗传转化体系更加完善,并获得了转基因植株。3、提取0.5g转基因及对照小油桐叶片脂肪酸进行反相薄层层析,结果初步显示转基因小油桐叶片脂肪酸组成成分没有发生改变。4、抗寒生理指标检测结果表明,与对照相比转基因植株表现出抗寒性增强的生理生化特性。筛选出两个抗寒能力最强的转基因小油桐单株,经低温处理后发现,与对照相比较,其叶绿素破坏较轻,过氧化氢酶、过氧化物酶活性增加更多,丙二醛含量、脯氨酸含量也有较多增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第—部分 文献综述
• 一、小油桐概述
• 1 小油桐的植物学形态特征
• 2 小油桐的繁殖及栽培技术
• 3 小油桐的化学成份
• 3.1 小油桐种子中的化学成份
• 3.2 小油桐根中的化学成份
• 3.3 小油桐叶中的化学成份
• 4 小油桐制取生物柴油
• 5 小油桐分子生物学研究进展
• 5.1 小油桐分子标记研究
• 5.2 小油桐基因文库构建
• 5.3 小油桐重要功能基因的克隆
• 5.3.1 核糖体失活蛋白基因的分离与克隆
• 5.3.2 脂类合成相关基因的分离与克隆
• 5.3.3 小油桐其他基因的克隆
• 5.4 小油桐的转基因研究
• 6 小油桐的抗寒性研究
• 6.1 低温胁迫对小油桐的影响
• 6.2 影响小油桐抗寒性的因素
• 6.2.1 地理差异
• 6.2.2 预处理
• 6.3 基因工程提高小油桐抗寒性
• 二、不饱和脂肪酸的抗寒机理
• 1 低温胁迫对细胞生物膜的影响
• 2 膜脂中不饱和脂肪酸与抗寒的关系
• 3 植物脂肪酸脱饱和酶研究进展
• 3.1 植物脂肪酸脱饱和酶分类
• 3.1.1 脂酰-ACP脱饱和酶
• 3.1.2 脂酰-脂去饱和酶
• 3.2 植物脂肪酸脱饱和酶结构
• 3.3 植物脂肪酸脱饱和酶的进化
• 4 ω-3植物脂肪酸脱饱和酶与植物的抗寒关系
• 4.1 ω-3植物脂肪酸脱饱和酶的种类
• 4.2 FAD7基因的克隆与植株抗寒的关系
• 4.3 FAD8基因的研究进展与植株抗寒的关系
• 第二部分 实验部分
• 1、材料与方法
• 1.1 研究材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 农杆菌菌株及其质粒
• 1.2 主要试剂及配方
• 1.3 研究方法
• 1.3.1 研究材料
• 1.3.2 影响小油桐再生及其遗传转化因素的研究
• 1.3.2.1 萌发培养基对小油桐种苗萌发的影响
• 1.3.2.2 6-BA与NAA组合对小油桐胚乳再生的影响
• 1.3.2.3 6-BA与IBA组合对小油桐外植体再生的影响
• 1.3.2.4 6-BA与NAA组合对小油桐外植体再生的影响
• 1.3.2.5 无菌苗苗龄对小油桐外植体再生的影响
• 3对对小油桐外植体再生的影响'>1.3.2.6 AgNO₃对对小油桐外植体再生的影响
• 1.3.2.7 生根培养基对小油桐再生芽生根的影响
• 1.3.2.8 卡那霉素浓度对小油桐外植体再生的影响
• 1.3.2.9 侵染时间对小油桐遗传转化的影响
• 1.3.2.10 乙酰丁香酮浓度对小油桐遗传转化的影响
• 1.3.2.11 恢复生长时间对小油桐遗传转化的影响
• 1.3.3 农杆菌介导小油桐遗传转化的研究
• 1.3.3.1 目的基因载体导入农杆菌
• 1.3.3.2 农杆菌介导小油桐遗传转化
• 1.3.3.3 转基因小油桐检测
• 1.3.3.3.1 GUS活性检测
• 1.3.3.3.2 基因组PCR检测
• 1.3.3.3.3 PCR扩增反应
• 1.3.3.3.4 RT-PCR检测
• 1.3.4 转基因小油桐叶片脂肪酸成份分析
• 1.3.5 转基因小油桐植株抗寒性研究
• 2、结果与分析
• 2.1 影响小油桐再生及遗传转化因素的研究
• 2.1.1 萌发培养基对小油桐种苗萌发的影响
• 2.1.2 6-BA与NAA、2,4-D组合对小油桐胚乳再生的影响
• 2.1.3 6-BA与IBA组合对小油桐外植体再生的影响
• 2.1.4 6-BA与NAA组合对小油桐外植体再生的影响
• 2.1.5 无菌苗苗龄对小油桐外植体再生的影响
• 3对对小油桐外植体再生的影响'>2.1.6 AgNO₃对对小油桐外植体再生的影响
• 2.1.7 生根培养基对小油桐再生芽生根的影响
• 2.1.8 卡那霉素浓度对小油桐外植体再生的影响
• 2.1.9 侵染时间对小油桐遗传转化的影响
• 2.1.10 乙酰丁香酮浓度对小油桐遗传转化的影响
• 2.1.11 恢复生长时间对小油桐遗传转化的影响
• 2.2 农杆菌介导小油桐遗传转化的研究
• 2.2.1 转化体系的确定
• 2.2.2 转基因小油桐的获得
• 2.2.3 转基因小油桐的检测
• 2.2.3.1 GUS活性检测
• 2.2.3.2 基因组PCR检测
• PCR检测'>2.2.3.3 RT_PCR检测
• 2.3 转基因小油桐脂肪酸成分分析
• 2.4 转基因小油桐抗寒性实验
• 2.4.1 叶绿素含量测定
• 2.4.2 过氧化氢酶（CAT）活性的测定
• 2.4.3 过氧化物酶（POD）活性的测定
• 2.4.4 脯氨酸含量的测定
• 2.4.5 丙二醛（MDA）含量的测定
• 第三部分 分析与讨论
• 1 影响小油桐再生及转化的因素
• 2 FAD8基因的表达与转基因小油桐抗冷性
• 致谢
• 参考文献
• 附录 硕士研究生期间参与的工作
• 图版