脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及脱墨的初步研究

论文摘要

生物酶脱墨是当今国内外废纸回用研究的热点之一。已有的研究报道证明脂肪酶在生物脱墨过程中具有重要的作用。在脱墨过程中,脂肪酶主要是以分解油墨与纤维表面的连接料的方式释放出油墨粒子,对纤维强度和纸浆得率的影响较小,因此在生物脱墨的过程中有较大的应用潜力。为了能筛选到对油墨连接料有专一性降解作用的脂肪酶产生菌,本研究从印刷厂车间、排水渠内采集被油墨污染较严重的土样和水样,分离筛选到一株具有较高脂肪酶活性、能利用矿物油为唯一碳源,并分解油墨连接料的菌株LP502。经菌体形态、菌落特征观察,生理生化测定,16S rRNA基因以及gyrB基因全序列分析,初步鉴定该菌为乙酸钙不动杆菌(Acinitobacter calcoaceticus);通过酯酶特异性活性染色研究表明,该酶对脂肪酶底物有专一性催化作用,由两个同功酶构成;对该酶发酵条件进行了优化,最适培养基为:K2HPO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.1%,蛋白胨3%,MgSO4.7H2O 0.1%,矿物油0.5%,蔗糖1%,牛肉膏1%;最佳培养条件为:起始pH7.0,20 mL装液量,30℃,发酵时间72 h;酶活力达到25000U/L。利用该酶对废旧新闻纸进行生物脱墨的试验研究,并经过浮选、抄片,制成的再生纸白度值为224.9513,与未经脱墨的再生纸相比,二者白度值相差42.5315,具有统计学意义。该结果表明Acinitobacter calcoaceticus LP502所产脂肪酶能够有效地脱除油墨颗粒。构建了LP502的基因组文库,为进一步从该菌中克隆编码脂肪酶的基因奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 脂肪酶的研究概况
• 1.1 微生物脂肪酶产生菌
• 1.2 脂肪酶的分子结构及其改进研究
• 1.3 脂肪酶的应用
• 2 微生物脂肪酶产生菌筛选方法的讨论
• 2.1 自然界筛选方法
• 2.2 高产突变株
• 3 脂肪酶活力检测方法的比较
• 3.1 碱滴定法
• 3.2 比色法
• 3.3 平板测定法
• 4 脂肪酶基因表达、调控及其作用机制的研究进展
• 4.1 脂肪酶的基因片段
• 4.2 脂肪酶基因的调控表达
• 5 脂肪酶在生物脱墨中的应用
• 5.1 脱墨剂的选择
• 5.2 脱墨工艺
• 5.3 实验室浮选脱墨系统的设计与操作
• 6 小结
• 第二章 脂肪酶产生菌的筛选和鉴定
• 1 材料
• 1.1 土样来源
• 1.2 培养基
• 1.3 溶液与试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 平板初筛方法
• 2.2 脂肪酶活力测定的方法
• 2.3 菌株的鉴定
• 2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色法
• 3 结果
• 3.1 菌株的分离筛选
• 3.2 菌株 LP502 的鉴定
• 3.3 酯酶活性染色
• 4 讨论
• 4.1 脱墨菌株的筛选
• 4.2 分子鉴定
• 4.3 酯酶同功酶的初步研究
• 5 小结
• 第三章 产酶条件优化及脱墨应用研究
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 溶液与试剂
• 1.4 主要设备
• 2 方法
• 2.1 菌株发酵产酶条件优化
• 2.2 对废旧新闻纸脱墨效果研究
• 3 结果
• 3.1 产酶条件优化
• 3.2 脱墨效果研究
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 不动杆菌LP502 DNA 文库的构建
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 试剂和培养基
• 1.3 主要设备
• 2 方法
• 2.1 基因组文库的构建流程
• 2.2 DNA 的提取、酶切、脱磷酸化、连接
• 2.3 感受态细胞 DH5α的制备与转化
• 3 结果
• 3.1 DNA 的提取
• 3.2 DNA 的酶切
• 3.3 不动杆菌基因组文库的建立
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一：LP502 165 RDNA 全序列测定
• 附录二：LP502 GYRB 基因全序列测定
• 附录三：在读研期间发表论文情况