野油菜黄单胞菌控制hrpG、hrpX表达的调节基因的鉴定

论文摘要

hrp（hypersensitive reaction and pathogenicity）基因决定着病原细菌对寄主植物的致病性和诱导非寄主植物过敏反应。在野油菜黄单胞菌致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）中,hrpG、hrpX是目前已鉴定出的控制hrp基因表达的关键调节基因,而关于hrpG、hrpX上游的调节基因几乎一无所知,因此,鉴定控制hrpG、hrpX表达的调节基因,对于研究hrp基因的表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制都具有重要意义。本研究利用蔗糖敏感型自杀基因sacB作为报告基因,将报告质粒pL6sacBhrpX和pL6sacBhrpG通过三亲本接合的方法导入Xcc 8004功能注释为调节基因的253个突变体,从中筛选出6个候选调节基因XC3799、XC2253、XC3056、XC1734、XC2650和XC2251。在初步获得6个候选调节基因的基础上,本研究又利用gus基因作为报告基因,建立了GUS报告系统加以验证。首先构建获得GUS报告质粒pL6gushrpX和pL6gushrpG,然后将它们与另外两个GUS报告质粒pLGX和pLGG通过三亲本接合的方法分别导入上述候选基因对应的突变体（073G12、125H08、151D11、NK1668、PK2558和NK2168）,在MMX培养基中检测GUS活性。结果显示,与野生型Xcc 8004相比,突变体073G12、125H08、151D11、NK1668和NK2168中hrpG、hrpX基因的表达量（即GUS活性）均表现为显著降低,表明这5个突变体所对应的基因XC3799、XC2253、XC3056、XC1734和XC2251正向调控hrpG、hrpX基因的表达,而突变体PK2558对应的基因XC2650非正向调控hrpG、hrpX基因的表达。通过功能反式互补,构建获得调节基因XC2253的突变体125H08和XC3056的突变体151D11的互补菌株,然后进行突变体及互补菌株的表型检测。结果表明,XC2253和XC3056这两个调节基因都可影响Xcc的致病能力,但基本上不影响Xcc诱导辣椒ECW-10R的过敏反应,也不影响Xcc胞外多糖的分泌及胞外蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性;调节基因XC2253可影响Xcc的游动性及生物膜的形成,而另一调节基因XC3056不影响Xcc的游动性及生物膜的形成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种概述
• 1.1.1 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种简介
• 1.1.2 Xcc基因组研究概况
• 1.2 植物病原细菌的Ⅲ型分泌系统与hrp基因
• 1.2.1 Ⅲ型分泌系统
• 1.2.2 hrp基因簇的组成及功能
• 1.3 植物病原细菌Ⅲ型分泌系统调控机制的研究进展
• 1.3.1 第Ⅰ类hrp基因簇的调控系统
• 1.3.2 第Ⅱ类hrp基因簇的调控系统
• 1.4 本课题研究的目的、内容和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 生化试剂与寄主材料
• 2.1.3 抗生素和其它药剂
• 2.1.4 溶液与缓冲液
• 2.1.5 本研究所用的引物
• 2.1.6 培养基
• 2.2 常规试验操作方法
• 2.2.1 菌株培养条件及保存
• 2.2.2 总DNA的提取
• 2.2.3 DNA的纯化和DNA的沉淀
• 2.2.4 快速碱裂解法少量提取质粒DNA
• 2.2.5 PCR反应
• 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.7 限制性内切酶酶切
• 2.2.8 DNA片段试剂盒回收
• 2.2.9 DNA连接
• 2.2.10 电脉冲感受态细胞的制备
• 2.2.11 电脉冲转化
• 2.2.12 三亲本接合
• 2.3 鉴定调节基因的方法
• 2.3.1 利用sacB报告系统筛选候选调节基因
• 2.3.2 利用GUS报告系统鉴定调节基因
• 2.4 调节基因突变体互补菌株的构建方法
• 2.5 调节基因对Xcc表型影响的检测方法
• 2.5.1 调节基因与致病性的关系检测
• 2.5.2 调节基因对过敏反应的影响检测
• 2.5.3 调节基因对致病相关生化因子的影响检测
• 2.5.4 调节基因对游动性的影响检测
• 2.5.5 调节基因对生物膜形成的影响检测
• 3 结果与分析
• 3.1 获得候选调节基因
• 3.1.1 获得含sacB报告质粒的三亲接合子
• 3.1.2 候选调节基因的筛选结果
• 3.2 调节基因的鉴定结果
• 3.2.1 获得含GUS报告基因的重组质粒
• 3.2.2 获得含GUS报告质粒的三亲接合子
• 3.2.3 确定调节基因
• 3.3 构建获得调节基因突变体的互补菌株
• 3.3.1 PCR扩增获得互补基因片段
• 3.3.2 获得互补菌株
• 3.4 调节基因对Xcc表型的影响
• 3.4.1 调节基因与致病性的关系
• 3.4.2 调节基因对过敏反应的影响
• 3.4.3 调节基因对致病相关生化因子的影响
• 3.4.4 调节基因对游动性的影响
• 3.4.5 调节基因对生物膜形成的影响
• 4 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 XC3799、XC2253、XC3056、XC1734和XC2251是目的调节基因
• 4.1.2 调节基因XC2253和XC3056与Xcc的致病性有关
• 4.1.3 调节基因XC2253和XC3056与过敏反应基本无关
• 4.1.4 调节基因XC2253和XC3056与Xcc的胞外酶及胞外多糖的分泌无关
• 4.1.5 调节基因XC2253与Xcc的游动性及生物膜形成有关
• 4.2 讨论
• 4.2.1 关于Xcc控制hrpG和hrpX表达的调节基因
• 4.2.2 关于调节基因XC2253和XC3056在Xcc致病过程中的作用
• 4.2.3 关于调节基因XC2253和XC3056与过敏反应的关系
• 4.2.4 关于调节基因的调控机制
• 4.2.5 本研究鉴定调节基因的范围
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录A
• 附录B