中国HIV感染长期不进展者与典型进展者遗传、免疫及HIV变异特点研究

论文摘要

[目的]：通过对中国人群HIV感染后出现的长期不进展者（LTNP）和典型进展者（TP）的遗传背景,机体对HIV免疫应答水平及两组人群体内HIV毒株基因变异等多方面进行综合研究,探讨两组人群的流行病学特点,影响HIV感染疾病进展和病毒控制的因素。[方法]：本研究共选取39例受试者,并按照其疾病进展状态分为两组：将同HIV感染高发区、同一时间段内、经血液途径感染的21例长期不进展患者作为主要研究对象,18例经血液途径感染,在年龄、性别、感染时间等方面与之匹配的典型进展者作为对照。对两组研究对象的HLA型别进行PCR-SBT检测,利用流式细胞术进行外周血淋巴细胞亚群检测,利用假病毒方法检测血浆中和抗体水平,以及采用RT-PCR扩增病毒gag.env V3-V4及pol基因片段,纯化PCR产物后测序,从病毒亚型,选择压力,糖基化位点,病毒嗜性,CTL抗原表位变异等角度分析研究对象体内HIV基因的变异特点。[结果]：入组时LTNP组平均感染时间为16±1.4年,显著长于TP组的8±2.2年（P<O.001）。LTNP组平均病毒载量为2.76±0.93（10g copies/ml）,显著低于TP组的4.65±1.06（1og copies/ml）（P<O.001）,而LTNP组的NK细胞,CD4+T细胞计数分别为156±104/μl,544±1 58/μl显著高于TP组的78±43/μl,80±124/μl（NK:P=0.004, CD4+T:P<0.001）；LTNP组的纯真CD4+T细胞及记忆CD4+T细胞计数分别为254±98/μl,291±99/μl,显著高于TP组的31±74/μl,42±53/μl（纯真CD4+T:P<0.001,记忆CD4+T:P<0.001）。LTNP组CD8+T细胞表达CD38+的比例为52.4±12.8%,显著低于TP组的83.1±14.7%（P<0.001）。相关性显示,CD4+T细胞计数与病毒载量（r=-0.55,P<0.001）呈显著负相关,CD4+T细胞计数与CD8+T细胞的CD38+表达比例也呈显著负相关（r=-0.667,P<0.001）。遗传背景方面,HLA-I类分子A*30与B*57在LTNP组的表达频率分别为23.8%,8.3%,均显著高于TP组的4.3%,0（A*30:P=0.01,B*57:P=O.033）；HLA-Ⅱ类分子DRBl*15在LTNP组的表达频率为10.5%,显著低于TP组的33.3%（P=0.046）。在中和抗体方面,LTNP组对B16,SF162毒株达到有效抑制率的比例分别为23.8%,66.7%,显著高于TP组的0,16.7％（B16:P=0.009,SF162:P=0.001）,而uNP组的B细胞计数为174±48/μl,显著高于TP组的92±68/μl（P=0.001）。本研究所有研究对象体内毒株均为B’亚型并且以CCR5嗜性为主,env区V3-V4为基因距离最大的区段,年平均变异率LTNP组小于或类似于TP组,且V4区在LTNP组无明显选择压力,而TP组则存在正向选择压力；糖基化位点丢失率在LTNP组有高于TP组的趋势,但未达到显著差异；本研究中所有毒株顶端4肽的组成主要为GPGR,GPGQ,GQGR,TP组以典型欧美B亚型顶端4肽GPGR为主（53.3%）,而LTNP组则以泰国B’亚型GPGQ为主（53.3%）,但两组在构成比上未达到显著性差异；共发现19种表位突变,但突变率在两组研究对象中没有显著性差异。[结论]：NK细胞计数的减少,纯真与记忆CD4+T细胞计数减少以及异常增高的CD8+T细胞激活水平可能是引起HIV/AIDS疾病进展的原因。中和抗体应答宽度可能延缓病情进展,B细胞数量的差异可能是导致中和抗体应答宽度不同的原因之一。HLA-DRB1*15可能促进AIDS疾病进展,而HLA-B*57在我国HIV感染人群中同样具有保护作用,HLA-A*30也可能具有延缓疾病进程的作用,但尚需进一步扩大样本量进行研究。以河南地区为主经血液途径HIV感染者体内,毒株以B’亚型为主要流行株,且大部分为CCR5嗜性。LTNP组与TP组在V4区受到不同的选择压力,V4区生物学功能的进一步研究有可能揭示这一差异在两组人群疾病进展中的作用。

论文目录

• 英文缩略词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1 研究对象及标本处理
• 1.1 标本来源及入选标准
• 1.2 标本处理
• 1.2.1 主要仪器与设备
• 1.2.2 主要试剂
• 1.2.3 实验步骤
• 2 淋巴细胞亚群检测
• 2.1 标本来源
• 2.2 主要仪器和设备
• 2.3 主要试剂
• 2.4 实验步骤
• 3 bDNA法检测血浆病毒载量
• 3.1 标本来源
• 3.2 主要仪器和设备
• 3.3 主要试剂
• 3.4 实验步骤
• 4 全血基因组DNA提取
• 4.1 标本来源
• 4.2 主要仪器设备
• 4.3 主要试剂
• 4.4 实验步骤
• 5 HIV/AIDS患者HLA型别测定
• 5.1 标本来源
• 5.2 PCR-SBT检测HLA型别原理
• 5.3 主要仪器设备
• 5.4 主要试剂
• 5.5 实验步骤
• 6 HIV/AIDS患者血浆中和抗体滴度测定
• 6.1 标本来源
• 6.2 假病毒检测血浆中和抗体滴度实验原理
• 6.3 实验步骤
• 7 HIV/AIDS患者病毒基因变异检测
• 7.1 标本来源
• 7.2 主要仪器设备
• 7.3 主要试剂
• 7.4 主要生物信息分析工具
• 7.5 HIV RNA提取
• 7.6 RT-PCR
• 7.6.1 gag、env、pol基因引物序列及位置
• 7.6.2 gag基因RT-PCR
• 7.6.3 env基因RT-PCR
• 7.6.4 pol基因RT-PCR
• 7.6.5 结果判定
• 7.6.6 PCR扩增产物回收
• 7.6.7 核酸序列测定
• 7.6.8 序列分析方法
• 8 统计学分析
• 实验结果
• 1 研究对象入组时基本情况和病毒载量结果比较
• 2 淋巴细胞亚群检测结果
• 3 HLA测定结果
• 4 血浆中和抗体检测结果
• 5 病毒基因变异结果
• 5.1 RT-PCR扩增gag、env、pol结果
• 5.2 HIV-1亚型分别及进化树分析
• 5.3 LTNP组与TP组在不同基因片段的基因距离比较
• 5.4 选择压力比较
• 5.5 env区糖基化位点比较
• 5.6 辅助受体使用预测
• 5.7 V3环顶端4肽比较
• 5.8 CTL表位突变情况
• 讨论
• 1 外周血淋巴亚群的比较
• 1.1 NK细胞
• 1.2 CD4+T细胞
• 1.3 CD8+T细胞
• 2 不同HLA型别对疾病进程的影响
• 3 中和抗体应答及B细胞数量差异
• 4 HIV基因变异对疾病进程的影响
• 4.1 病毒亚型比较
• 4.2 基因距离及选择压力分析
• 4.3 糖基化位点分析
• 4.4 V3环病毒嗜性及顶端4肽分析
• 4.5 CTL抗原表位突变分析
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢