论文题目: 水稻NADP-苹果酸酶与逆境关系的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 园林植物与观赏园艺
作者: 程玉祥
导师: 柳蔘奎
关键词: 水稻,苹果酸酶,逆境,同工酶,特性差异
文献来源: 东北林业大学
发表年度: 2005
论文摘要: NADP-苹果酸酶（NADP-ME）是在二价金属离子存在下催化对苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO2、NADPH反应的酶,它广泛地存在于动物、植物、细菌等生物体中,参与多种代谢,是生物体生命活动中重要的酶之一。本研究室在前期的研究中,针对我国东北地区的苏打盐碱地的碳酸盐逆境（NaHCO3,Na2CO3）为研究对象,采用分子生物学手法,在碳酸盐逆境下克隆了水稻的NADP-ME2基因（GeneBank Accession No.AB053295）。本论文以水稻（Oryza sativa L.）为材料,对水稻的NADP-ME与逆境关系做了探讨研究。目前报道水稻的NADP-ME有四种同工酶,为了深入了解各同工酶与逆境的关系,本研究对水稻NADP-ME的四种同工酶在逆境下的表达特性及差别进行了比较性研究,也探讨了在逆境下水稻的地上部与地下部NADP-ME的酶活性的变化规律。为了进一步明确NADP-ME同工酶之间特性的差异,本研究利用大肠杆菌表达体系,通过GST融合蛋白纯化了二个水稻NADP-ME蛋白,在体外对其酶的生物化学特性进行了比较研究。在酵母表达体系中表达水稻的NADP-ME基因后,初步对其抗逆性进行了探讨。主要得到了如下结果: 1、分析得到四种水稻NADP-ME同工酶之间的同源性都超过75%,氨基酸序列有较高的相似性。利用PSORT（Prediction of protein localization sites）分析的结果:NADP-ME1在N-末端带有质体转酶肽,被预测存在于叶绿体;而NADP-ME2、NADP-ME3被分别预测定位于细胞膜、内质网,NADP-ME4是定位细胞质中。我们用绿色荧光蛋白（GFP蛋白）分子标记方法在遗传转化的拟南芥中探讨了NADP-ME2在细胞的的定位情况,结果表明,NADP-ME2-GFP融合蛋白在遗传转化的拟南芥根细胞的细胞膜部位大量表达,这表明了NADP-ME2在植物体中存在于细胞膜。预测及实验的结果表明水稻的NADP-ME四种同工酶存在于细胞内不同的亚细胞内起着功能,各自扮演着不同的角色。 2、用Northern杂交方法对水稻NADP-ME基因的表达特性研究。首先对水稻NADP-ME2的表达做了解析,在正常的条件下,水稻的叶、茎中NADP-ME2的mRNA表达量较高,而在根中则较低,NADP-ME2基因的mRNA表达不受光的诱导,表明NADP-ME2可能是水稻非光合型的NADP-ME。然而,水稻质体型NADP-ME1（C3植物质体型NADP-ME）基因的表达却受光的诱导,这些结果未见报道。在NaCl、NaHCO3、Na2CO3、10%PEG逆境处理下,水稻NADP-ME2基因的表达量明显地增高,表明水稻的NADP-ME2基因表达与逆境存在着应答关系。用半定量RT-PCR的方法对四种水稻NADP-ME基因与逆境应答关系进行了探讨,表明水稻不同NADP-ME基因对环境逆境信号产生了不同应答反应特性。 3、通过天然活性电泳及NADP-ME特异酶活性染色方法,从水稻中检测出四种NADP-ME同工酶,这一结果和以前报道的不完全相同（在C3植物中仅检测出一条NADP-ME特异带）。在NaHCO3、Na2CO3、NaCl及PEG6000逆境下,水稻NADP-ME特异酶活性都明显的增高,从蛋白表达水平上进一步表明了水稻的NADP-ME与逆境存在着显著的应答关系。
论文目录:
摘要
Abstract
1 绪论
1．1 引言
1．2 植物的NADP-ME研究概况
1．2．1 植物NADP-ME基因的克隆
1．2．2 植物NADP-ME基因表达与其影响因子
1．3 植物NADP-ME酶的功能及其特性
1．3．1 NADP-ME在植物中定位及功能
1．3．2 植物中NADP-ME的纯化及其酶学特性
1．4 C_3植物中表达来源于C_4植物NADP-ME基因的研究进展
1．5 本课题的主要研究内容及意义
1．5．1 水稻NADP-ME的研究现状
1．5．2 本文研究内容
2 水稻NADP-ME基因表达与逆境关系的研究
2．1 材料与方法
2．1．1 材料
2．1．2 方法
2．2 结果与分析
2．2．1 两种水稻NADP-ME基因的cDNA获得
2．2．2 水稻四种NADP-ME的氨基酸比较序列分析
2．2．3 水稻NADP-ME_2-GFP转基因拟南芥的分子鉴定
2．2．4 NADP-ME_2-GFP在转化的拟南芥植物细胞中定位
2．2．5 水稻NADP-ME_2基因的mRNA表达特性
2．2．6 四个水稻NADP-ME基因在逆境下的mRNA表达特性
2．3 本章小结
3 水稻NADP-ME酶活性与逆境关系的研究
3．1 材料与方法
3．1．1 材料
3．1．2 方法
3．2 结果与分析
3．2．1 水稻NADP-ME是同工酶
3．2．2 水稻的NADP-ME与逆境的应答
3．3 本章小结
4 两种水稻NADP-ME同工酶在大肠杆菌中表达
4．1 材料与方法
4．1．1 材料
4．1．2 方法
4．2 结果与分析
4．2．1 两种水稻NADP-ME基因在大肠杆菌中的表达及纯化
4．2．2 大肠杆菌表达两种水稻NADP-ME融合蛋白特性的比较
4．3 本章小结
5 水稻NADP-ME基因在酵母中抗性的研究
5．1 材料与方法
5．1．1 材料
5．1．2 方法
5．2 结果与分析
5．2．1 NADP-ME_2、NADP-ME_3在重组酵母转化体中的抗性实验
5．3 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
发布时间: 2005-10-21
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