重组人源前列腺特异性抗原（rPSA）-hFc融合蛋白在昆虫细胞中的表达与研究

论文摘要

近年来,数以千计的不同种类蛋白已经成功利用昆虫细胞表达系统进行表达,其中包括多种蛋白酶,细胞表面蛋白。昆虫细胞表达出的蛋白具有较好的空间构型,糖基化修饰,并且表达量也相对较高,因此利用昆虫细胞表达系统表达出的蛋白,被广泛用在蛋白质功能、蛋白质相互作用的研究中,并在产品开发中被用于制备高效疫苗。在以往前列腺特异性抗原（PSA）检测试剂盒中,标准品通常是由天然蛋白纯化而来,但这种标准品存在诸多缺点,如批次间稳定性差,不利于纯化得到单一形式蛋白,纯化成本较高等等,为了解决这些问题,本实验利用昆虫细胞表达系统Bac to Bac表达重组前列腺特异性抗原。为方便纯化提高重组前列腺特异性抗原的稳定性,使用人源IgG2的Fc片段融合PSA进行表达。实验中,在昆虫细胞中表达并纯化出的PSA-Fc融合蛋白,标准品的替代实验证明重组PSA可以有效替代PSA国际标准品,本实验为前列腺特异性抗原诊断试剂盒的标准品替代奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 实验部分
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Bac to Bac 细胞表达系统
• 1.1.2 溶液
• 1.1.3 培养液
• 1.1.4 PSA 单克隆抗体
• 1.1.5 其他
• 1.2 方法
• 1.2.1 CRL-1740 前列腺癌细胞系的培养
• 1.2.2 CRL-1740 前列腺癌细胞系的RNA 抽提与反转录
• 1.2.3 PSA 的基因克隆
• 1.2.3.1 PSA 的巢式 PCR 克隆
• 1.2.3.2 扩增产物的酶切验证
• 1.2.3.3 扩增产物胶回收后进行T 载体转化
• 1.2.4 pFastBac-Fc-GP64 质粒的构建
• 1.2.4.1 GP64 信号肽的构建
• 1.2.4.2 人源IgG2Fc 的克隆并引入HindIII 和XhoI 酶切位点
• 1.2.5 重组PSA 杆状病毒的获得与蛋白表达的验证
• 1.2.5.1 Donor 质粒转化DH10BacTM
• 1.2.5.2 Bacmid-PSA 重组杆粒的抽提
• 1.2.5.3 重组杆粒的验证
• 1.2.6 PSA 重组杆状病毒的获得
• 1.2.6.1 HighFive 昆虫细胞的培养
• 1.2.6.2 PSA 重组杆状病毒的包装与获得
• 1.2.7 PSA 蛋白的大量表达
• 1.2.7.1 High Five 细胞的悬浮驯化培养
• 1.2.7.2 High Five 细胞表达重组PSA-Fc
• 1.2.8 PSA 蛋白纯化
• 1.2.9 PSA 抗体的纯化和辣根过氧化物酶（HRP）的标记
• 1.2.9.1 硫酸铵盐析法纯化抗体
• 1.2.9.2 抗体与HRP 酶的交联（戊二醛两步法）
• 1.2.9.3 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2.9.4 夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2.9.5 Western-Blot
• 第二章 结果
• 2.1 PSA 基因的克隆
• 2.1.1 CRL-1740 前列腺癌细胞株的RNA 抽提
• 2.1.2 PSA 基因的巢式 PCR
• 2.2 pFASTBac-Fc-GP64 质粒的构建
• 2.3 pFastBac-PSA-GP64-Fc 转移质粒的构建
• 2.4 重组PSA 杆状病毒的制备与扩增
• 2.5 重组PSA 杆状病毒的制备
• 2.6 High Five 昆虫细胞的大规模培养与蛋白的制备
• 2.7 Biocheck 游离PSA 检测试剂盒检测国际标准品和 rPSA在Biocheck 试剂盒中的相关性
• 2.8 自制游离PSA 检测试剂盒检测国际标准品和rPSA 在自制游离PSA 检测试剂盒中的相关性
• 2.9 自制总PSA 检测试剂盒衡量国际标准品，重组纯化PSA作为标准品的线性相关性
• 第三章 讨论
• 已申请专利
• 参考文献
• 文献综述
• 一、蛋白纯化前必要的信息收集
• 二、蛋白样品的提取
• 三、蛋白的分离
• 四、抗体的工程化纯化
• 参考文献
• 附录I--已申请专利
• 附录II—PSA 基因克隆测序比对结果
• 附录III—GP64 信号肽测序比对结果
• 附录IV—HumanIgG2Fc 测序比对结果
• 致谢