论文摘要
原发性肝癌（简称肝癌）是我国常见的恶性肿瘤之一,全球每年新发肝癌的55%发生在我国,其年死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第三位,我国肝癌诊治形式十分严峻;目前常用的肝癌非手术疗法有:肝动脉栓塞化疗、瘤内无水酒精注射、射频消融等,疗效均不理想。放疗是恶性肿瘤治疗的三大手段之一,近年来,随着三维适形放疗和调强放疗技术的发展,放疗已成为肝癌治疗的有力武器。肿瘤细胞对辐射的敏感性是影响肿瘤放疗效果的关键问题之一,辐射敏感性受辐射诱导表达的基因调控,寻找肿瘤的辐射敏感基因,阐明辐射对基因的诱导表达机制及其与肿瘤辐射敏感性之间的关系,对提高肿瘤放疗效果、延长肿瘤患者的生存期具有重要意义。IER5是Immediate early response 5的简称,属于早期慢反应基因家族,早期反应基因的激活是细胞和染色体对外在刺激反应最初和最重要的一步。研究显示IER5基因存在于一些肿瘤和正常组织中,其表达变化会影响到细胞周期和凋亡。2005年,我们和Kis等人几乎同时采用基因芯片技术对一些基因进行了辐射效应筛查,结果发现辐射后IER5基因表达上调。因此,我们开始关注该基因,先后利用基因沉默与过表达等技术对IER5基因的辐射效应及其生物学功能进行研究,还确定了IER5基因辐射应答的启动子区域。实验发现,辐射能诱导IER5基因mRNA水平表达上调;该基因沉默（RNAi）能促进细胞生长,且对辐射表现出拮抗性;该基因过表达能抑制细胞生长,并促进辐射诱导的细胞凋亡,生物信息学分析预测IER5基因启动子的最可能范围为-408bp到-238bp。这些实验均表明IER5基因是一种与癌症放疗有关的基因,在辐射情况下其生物学功能类似于抑癌基因。正因为如此,我们决定对IER5基因做深入探索,拟采用生物信息学、分子和细胞生物学等方法,利用HepG2细胞对IER5基因转录调控机制进行研究,旨在揭示IER5基因在肝癌放疗中的转录调控机制,为今后临床上肝癌放疗增敏和药物开发提供理论依据。以上研究结果提示我们IER5基因可能为肝癌辐射敏感基因,应对其进行更深入的研究。目的:IER5属于早期反应基因,其作用类似于抑癌基因,辐射后出现表达上调并可促进细胞凋亡。目前,国内外对IER5基因的研究不多,检索到的一些文献大多是在阐述IER5的基因结构信息与生物学功能。因此本研究的目的是通过分析转录因子对IER5启动子转录活性的影响,旨在揭示IER5基因在肝癌放疗中的转录调控机制,为今后临床上肝癌放疗增敏和药物开发提供理论依据。方法:首先,根据网址http://thr.cit.nih.gov/molbio/proscan,对IER5基因启动子内所含潜在顺式作用元件的分析结果,构建IER5基因的荧光素酶报告载体,利用启动子突变分析实验确定IER5基因启动子内的顺式作用元件的种类和分布。其次,在HepG2细胞系内,利用共转染方法分析辐射前后转录因子对IER5基因启动子转录活性的影响;利用EMSA方法分析转录因子GCF在体外是否与IER5基因启动子内的相应结合位点结合以及辐射前后该转录因子与IER5基因启动子内相应结合位点结合有无变化;采用CHIP方法确定转录因子GCF在体内是否与IER5基因启动子内的相应结合位点结合以及辐射前后该转录因子与IER5基因启动子内相应结合位点结合有无变化。结果:1 IER5基因启动子-388～-382区域、-274～-270区域内的GCF结合位点突变可以引起启动子转录活性显著增加（P<0.05）,并且照射前后转录活性变化明显（P<0.05）;而-362～-357区域内的NFI结合位点突变可以引起启动子转录活性显著下降（P<0.05）,并且照射前后转录活性变化明显（P<0.05）;-351～-345区域内的TTR inverted-repeat结合位点突变对启动子转录活性影响不大（P>0.05）,并且照射前后没有明显变化（P>0.05）。2转录因子GCF在体外与IER5基因启动子-388～-382区域、-274～-270区域内的GCF结合位点相互结合,并且在辐射下,随着辐射剂量的增加（0Gy、2Gy、4Gy）,转录因子GCF与启动子相应结合区域结合能力减弱。3在HepG2细胞内转录因子GCF与IER5基因启动子-388～-382区域、-274～-270区域内的GCF结合位点相互结合,并且随着辐射剂量的增加（0Gy、2Gy、4Gy）,转录因子GCF与启动子相应结合区域结合能力减弱。结论:1 IER5基因启动子-388～-382和-274～-270区域存在起负性调控作用的转录因子GCF顺式作用元件,并且随辐射剂量的增加转录因子GCF抑制作用减弱;-362～-357区域存在起正性调控作用的转录因子NFI顺式作用元件,并且随辐射剂量的增加转录因子NFI促进作用增强。2转录因子GCF通过与IER5基因启动子内的顺式作用元件相互作用,而抑制该基因的表达,进一步在IER5基因的转录调控中发挥负性调节作用,并且转录因子GCF发挥负性调节作用随着辐射剂量的增加而减弱。