一种来源于Enterobacter sp.CGMCC2487菌株的木糖苷酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究

论文摘要

紫杉醇为红豆杉植物的次生代谢产物,对卵巢癌、乳腺癌等癌症有很好的治疗作用。目前人们主要从红豆杉的树皮和枝叶中提取紫杉醇。在红豆杉中,紫杉醇的干重仅为0.02%,而7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量则是紫杉醇的10倍以上,但都作为废物而丢弃。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇去掉C-7位木糖基即转变为10-去乙酰紫杉醇,再通过一步酰化反应即可生成紫杉醇。因此,利用好这一资源具有广阔的前景。前期实验我们从东北红豆杉中筛选到一株能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇高效水解为10-去乙酰紫杉醇的微生物-Enterobacter sp. CGMCC2487。本实验将用构建基因组文库的方法筛选出Enterobacter sp. CGMCC2487木糖苷酶基因,把筛选到的基因连接到pET-23a载体和pHBM905A载体上,分别转化大肠杆菌和毕赤酵母进行表达。然后用High-Affinity Ni-NTA Resin纯化表达的木糖苷酶,以4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）为底物测定木糖苷酶的酶学性质,包括木糖苷酶的酶活、最适温度及温度稳定性、pH及pH稳定性,木糖对酶活的影响,金属离子等一些试剂对酶活的影响等。最后进行7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验,薄层色谱检测水解产物,研究水解效率。通过构建基因组文库,我们筛选到一个木糖苷酶基因,其开放阅读框长1680bp,编码559个氨基酸,编码的木糖苷酶分子量为63.2KDa,等电点为4.90。将该基因重组到E.coli BL21菌株中表达,得到的重组酶的最适pH为6.2,在pH5.0-8.0之间保持稳定。最适温度为50℃,在45-50℃之间保持稳定,酶活力半衰期为1h时的温度T1/2为50℃。该重组酶特异酶活、Km和Vmax分别为618.5mU/mg、2.43±0.0583mmol/L和20.17±0.4834μmol/（min-mg）。该重组酶对木糖比较敏感（抑制常数Ki=24.04mmol/L）,其酶活受PMSF,Co2+, Fe3+,Cu2+,Hg2+和Zn2+,SDS的抑制,但2mmol/L的Fe2+能显著提高该酶的酶活,使酶活达到原来的164%。根据该酶对7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解实验发现该酶不能将7-木糖-10-去乙酰紫杉醇水解为10-去乙酰紫杉醇,推测存在着另外一个能水解7位木糖基的木糖苷酶,目前正在克隆中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 紫杉醇
• 1.2 紫杉醇的来源
• 1.2.1 从植物中提取紫杉醇
• 1.2.2 利用植物细胞产生紫杉醇
• 1.2.3 真菌发酵法
• 1.2.4 紫杉醇的化学全合成
• 1.2.5 紫杉醇的半合成
• 1.3 生物转化在药物生产中的作用
• 1.3.1 生物转化及其优点
• 1.3.2 生物转化在紫杉醇生产中的应用
• 1.4 β-木糖苷酶的研究进展
• 1.4.1 β-木糖苷酶的分类
• 1.4.2 β-木糖苷酶的来源
• 1.4.3 β-木糖苷酶基因的克隆
• 1.4.4 β-木糖苷酶的酶学性质
• 1.4.5 β-木糖苷酶的结构特点和催化机制
• 1.4.6 β-木糖苷酶的应用前景
• 1.5 本实验相关研究背景
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 菌种活化
• 2.2.2 Enterobacter sp.CGMCC 2487基因组文库的构建
• 2.2.3 木糖苷酶基因的鉴定
• 2.2.4 木糖苷酶在大肠杆菌（E.coli BL21（DE3）plysS）中的表达
• 2.2.5 木糖苷酶的分离纯化
• 2.2.6 木糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达
• 2.2.7 木糖苷酶酶学性质的测定
• 2.2.8 木糖苷酶水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的研究
• 第三章 结果与分析
• 3.1 Enterobacter sp.CGMCC 2487基因组文库的构建
• 3.2 木糖苷酶基因的鉴定
• 3.3 Enterobacter sp.CGMCC 2487木糖苷酶基因在大肠杆菌（E.coli BL21（DE3）plysS）中的表达
• 3.3.1 表达载体的构建
• 3.3.2 木糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化
• 3.3.3 木糖苷酶的分离纯化
• 3.4 木糖苷酶在毕赤酵母中的表达
• 3.4.1 表达载体的构建
• 3.4.2 木糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达
• 3.5 木糖苷酶的酶学性质
• 3.5.1 酶活的测定
• 3.5.2 酶的最适pH和pH稳定性
• 3.5.3 酶的最适温度及温度稳定性
• 3.5.4 酶动力学参数的测定和D-木糖对酶活的影响
• 3.5.5 一些试剂对酶活的影响
• 3.6 木糖苷酶对7-木糖-10-去乙酷紫杉醇的水解
• 第四章 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢