论文摘要
目的：通过体外实验观察米非司酮对卵巢癌耐药细胞系SKOV3/DDP耐药性的影响,并对可能存在的相关机制进行探讨。方法：1.采用MTT法检测米非司酮对卵巢癌细胞系SKOV3及耐药细胞系SKOV3/DDP的细胞毒性作用,通过绘制量-效曲线筛选出细胞抑制率<5%时的非细胞毒性剂量,并将该剂量作为本实验的逆转剂量。同法,测定逆转剂量的米非司酮与DDP联合作用于SKOV3/DDP细胞后,细胞顺铂耐药性的变化。2.通过流式细胞仪（FCM）检测逆转剂量的米非司酮作用于SKOV3/DDP细胞前后不同时间点细胞周期的变化情况。3.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印记技术（Western Blot）检测Smac在SKOV3及SKOV3/DDP两种细胞系中InRNA及蛋白水平表达的差异,并进一步检测逆转剂量的米非司酮作用于SKOV3/DDP细胞后Smac mRNA及蛋白水平的表达变化。结果：1.MTT的结果显示：米非司酮对SKOV3及SKOV3/DDP细胞均有抑制作用,并呈现剂量依赖性。当米非司酮的浓度<5μM时,其对SKOV3及SKOV3/DDP两种细胞系均无明显的抑制作用（细胞的抑制率均<5%）,且经方差分析,5μM时细胞的抑制率与低浓度组的抑制率有显著性差异,故将5μM作为本实验的逆转剂量。将逆转剂量的米非司酮与DDP联合作用于SKOV3/DDP细胞后,细胞对顺铂的耐药性得以逆转,于24、48、72 h测得的逆转倍数分别为1.36、1.91、2.48倍。2.FCM检测结果显示：5μM的米非司酮分别作用于SKOV3/DDP细胞24、48、72 h后,随着作用时间的延长,细胞周期中G0/G1期所占的比例逐渐增加（48.7%、53.9%、55.1%、59.0%）,而S期所占的比例则逐渐减小（13.5%、9.6%、7.7%、5.8%）,细胞受阻于G0/G1期。3. RT-PCR结果显示：SKOV3与SKOV3/DDP细胞系Smac mRNA表达量的相对值（Smac mRNA/β-actin mRNA）具有显著性差异（1.00±0.05 vs 0.45±0.04,P<0.01）,将5μM米非司酮作用于SKOV3/DDP细胞24、48、72h后Smac mRNA表达量的相对值随着作用时间的延长而逐渐增加,分别为0.50±0.03、0.65±0.06、0.73±0.04,各组间差异具有统计学意义（p<0.05）,且与作用前相比Smac mRNA表达量的相对值显著增加,但仍小于SKOV3细胞表达量的相对值（P<0.05）。4. Western Blot结果显示SKOV3 Smac蛋白表达量的相对值（Smac/β-actin）显著高于SKOV3/DDP （0.67±0.03 vs 0.40±0.03,P<0.01）。5μM米非司酮作用SKOV3/DDP细胞24、48、72 h后Smac蛋白表达量的相对值随着作用时间的延长而逐渐增加,分别为0.42±0.01、0.46±0.01、0.50±0.02,各组间差异具有统计学意义（P<0.05）。24 h较作用前无显著差别（P>0.05）,48 h及72 h时分别较作用前Smac蛋白的表达量显著增加,但仍小于SKOV3细胞的相对值（P<0.05）。结论：1.米非司酮对SKOV3及SKOV3/DDP细胞生长具有抑制作用,且呈现剂量依赖性。5μM的米非司酮对SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药性具有一定的逆转作用,且呈现时间-效应关系。2.米非司酮逆转SKOV3/DDP细胞顺铂耐药性的可能机制为：米非司酮使SKOV3/DDP细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制细胞的增殖；通过上调Smac基因及蛋白水平的表达,促进卵巢癌耐药细胞的凋亡,进而间接逆转耐药。