产单核细胞李斯特菌PCR检测方法的建立及溶血素基因的克隆与表达

论文摘要

产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）是一种强致病性的食源性病原菌,已被WHO列为4种主要的食源性疾病之一,建立对该菌的快速、敏感、特异的检测方法是目前亟待解决的问题之一。LM的致病性与多种毒力因子有关,其中溶血素O（Listeriolysin O, LLO）是该菌的主要毒力因子,它存在于所有的致病性LM中。LLO是一种能结合胆固醇、可被巯基活化的细胞溶解素,由hlyA基因编码。本研究根据产单核细胞李斯特菌hlyA基因设计引物,进行PCR扩增,检测该方法的特异性和灵敏度。人工污染样品经Half-fraser和Fraser增菌后进行PCR检测,结果表明,产单核细胞李斯特菌扩增出234bp的条带,对照菌未扩增出目的条带,该方法的灵敏度为104 cfu/mL。人工污染样品的检出限为8 cfu/25g。说明PCR方法检测食品中产单核细胞李斯特菌具有快速、特异、敏感等特点,具有较高的实用价值。利用PCR技术扩增产单核细胞李斯特菌溶血素基因hlyA,将其与pMD18-T载体连接,重组质粒经酶切、PCR鉴定后命名为pMD18-T-hlyA。重新设计带BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点引物,从pMD18-T-hlyA扩增不含信号肽序列的目的片断,与pET32a载体连接。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后,重组菌pET32a-hlyA用IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE,纯化后进行Western blot和间接ELISA分析。结果表明,所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列的同源性为99%,重组菌在大肠埃希菌BL21中表达了80ku左右的融合蛋白,经可溶性分析该蛋白以包涵体形式存在,能被LM阳性血清所识别,这为进一步研制单抗、建立间接ELISA诊断方法提供了条件。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 产单核细胞李斯特菌研究进展
• 1.1 产单核细胞李斯特菌的危害
• 1.2 LM 的生物学特征
• 1.2.1 LM 的形态及培养特性
• 1.2.2 LM 的生化特性
• 1.2.3 LM 的理化特性
• 1.3 LM 传播途径
• 1.4 临床症状
• 1.4.1 人群临床症状
• 1.4.2 动物临床症状
• 1.5 LM 的致病机理及其毒力基因
• 1.5.1 LM 的致病机理
• 1.5.2 LM 的毒力基因
• 1.6 LM 分型
• 1.6.1 LM 的传统表型亚分型法
• 1.6.2 LM 的分子亚分型
• 1.7 LM 作为活疫苗载体的研究进展
• 第二章 产单核细胞李斯特菌检测技术研究进展
• 2.1 LM 的检测方法
• 2.1.1 传统分离鉴定法
• 2.1.2 免疫学检测
• 2.1.3 分子生物学检测
• 2.2 展望
• 试验研究
• 第三章 产单核细胞李斯特菌PCR 检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2 特异性试验
• 3.2.3 灵敏度试验
• 3.2.4 人工污染样的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 扩增条件优化
• 3.3.2 特异性试验结果
• 3.3.3 灵敏度试验结果
• 3.3.4 人工污染样的检测结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆与表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种和载体
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要溶液配方
• 4.2 方法
• 4.2.1 细菌DNA 的制备
• 4.2.2 hlyA 基因的扩增
• 4.2.3 hlyA 基因的克隆
• 4.2.4 原核表达载体的构建
• 4.2.5 重组菌的诱导表达
• 4.2.6 目的蛋白的纯化
• 4.2.7 重组蛋白的检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 引物A PCR 扩增结果
• 4.3.2 重组质粒鉴定
• 4.3.3 引物B PCR 扩增结果
• 4.3.4 hlyA 表达载体的构建
• 4.3.5 表达产物的SDS-PAGE 电泳检测
• 4.3.6 重组蛋白可溶性分析及纯化结果
• 4.3.7 重组蛋白的检测
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略语
• 致谢
• 作者简介