肝素酶1对前列腺癌细胞增殖、侵袭及骨破坏作用的影响

论文摘要

前列腺癌是欧美男性病死率第二位恶性肿瘤,在我国其发病率也逐年升高。超过80%的晚期前列腺癌患者会发生骨转移。骨转移会严重影响前列腺癌患者的生活质量并且是前列腺癌患者死亡的主要原因。骨性转移可引起疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓及其它神经受压等并发症,而这些并发症都是由于骨质破坏造成的。抑制骨质破坏的特异性治疗可以明显提高患者的生活质量并延长患者的生存时间。肝素酶1（HPSE1）是一种能切开乙酰肝素链的内切糖苷酶,而乙酰肝素链可以和许多生物活性分子结合,发挥生物调节功能。以往研究发现肝素酶1在多种肿瘤组织中高表达,而且与肿瘤的预后密切相关。另外肝素酶1在肿瘤细胞中过表达可以促进肿瘤的增殖、新生血管生成和向远处转移并且能抑制肿瘤细胞凋亡。最近的研究发现肝素酶1还与骨形成和骨折愈合相关,并且能促进骨髓瘤细胞向骨组织转移。但有关肝素酶1与前列腺癌及与前列腺癌骨转移所导致的骨破坏间的关系尚不清楚。研究目的:本实验拟建立肝素酶1过表达的前列腺癌细胞,并观察肝素酶1对前列腺癌细胞在体内外增殖、侵袭及对骨组织破坏作用的影响。研究方法:1.将插入人肝素酶1基因cDNA序列的真核表达载体pIRES2 -EGFP-HPSE1采用脂质体转染前列腺癌细胞系PC-3,并用G418稳定筛选得到过表达肝素酶1的细胞克隆,命名为PC-3-HPSE1。同时将pIRES2-EGFP空载体转染PC-3细胞并稳定筛选作为对照,命名为PC-3-EGFP。采用实时定量PCR、Western-blot和间接免疫荧光检测肝素酶1 mRNA和蛋白在两组细胞内的表达,并用ELISA法检测两组细胞内肝素酶1的酶活性。2.采用MTT法检测两组细胞在体外增殖情况,并用Transwell小室实验检测两组细胞在体外的侵袭力。建立裸鼠皮下移植瘤模型,定期观测肿瘤生长情况。6周后HE染色观察肿瘤组织形态及了解其它脏器的转移情况。采用免疫组化法检测肿瘤组织内肝素酶1的表达情况。3.采用胫骨内注射法建立裸鼠前列腺癌骨转移模型,定期观察裸鼠肿瘤生长、活动能力和肿瘤大小。4周后X线平片观察胫骨骨质破坏情况。取胫骨标本,肿瘤组织HE染色观察肿瘤形态,骨组织经脱钙后,HE染色观察肿瘤细胞在骨组织内生长情况及骨组织破坏程度。采用图形分析软件测量胫骨骨皮质面积,比较骨组织破坏程度。耐酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨细胞,比较两组破骨细胞的活性。研究结果:1.成功建立了稳定表达肝素酶1的PC-3细胞,实时定量PCR结果显示实验组PC-3-HPSE1细胞内肝素酶1的mRNA表达水平比对照组PC-3-EGFP细胞高8倍。Western-blot检测结果显示PC-3-HPSE1细胞内可检测到明显的条带,大小约为50kDa,与活性肝素酶1蛋白大小一致,而PC-3-EGFP细胞则检测不到。间接免疫荧光结果显示PC-3-HPSE1细胞内可见较强的红色荧光,而PC-3-EGFP细胞仅能观测到很弱的荧光。ELISA法检测细胞内肝素酶1活性结果显示PC-3-HPSE1细胞内肝素酶酶活性明显高于PC-3-EGFP细胞。2. MTT法检测细胞体外增殖能力,结果显示两组细胞体外增殖能力无显著差异。Transwell小室实验结果显示PC-3-HPSE1细胞穿膜细胞数明显多于PC-3-EGFP细胞。成功建立了两组细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,结果显示PC-3-HPSE1细胞从接种细胞到可于皮下触及肿瘤包块所需时间明显短于PC-3-EGFP细胞,在多个时间点PC-3-HPSE1细胞形成的肿瘤体积明显大于PC-3-EGFP细胞组。PC-3-HPSE1细胞组发现肺转移6例,而PC-3-EGFP细胞组仅发现2例肺转移。免疫组化染色显示PC-3-HPSE1细胞组肿瘤组织肝素酶1表达水平较高,而PC-3-EGFP细胞组肿瘤组织肝素酶1表达水平很低。3.成功采用胫骨内注射法建立了裸鼠前列腺癌骨转移模型,每只裸鼠都在注射肿瘤的左后肢形成肉眼可见的肿瘤。X线平片显示所有的动物模型均发生了溶骨性骨破坏,且PC-3-HPSE1组骨破坏程度高于PC-3-EGFP组。PC-3-HPSE1组有3例发生病理性骨折,而PC-3-EGFP组没有发生病理性骨折。HE染色显示骨皮质发生了不同程度的破坏,骨组织内可见少量肿瘤细胞,在骨破坏区可见大量破骨细胞。用图像分析软件分析裸鼠胫骨骨皮质面积,结果显示PC-3-EGFP组骨皮质面积明显小于PC-3-EGFP组。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色结果显示PC-3-HPSE1组破骨细胞活性明显强于PC-3-EGFP组。结论:1.通过Real-Time PCR、Western-blot和间接免疫荧光检测,证实成功建立了过表达肝素酶1的前列腺癌细胞PC-3-HPSE1,PC-3-HPSE1细胞外源性表达的肝素酶1蛋白具有肝素酶酶活性。并且PC-3-HPSE1细胞在裸鼠体内生长时也能稳定表达肝素酶1。2.虽然肝素酶1过表达不能促进PC-3细胞在体外的增殖能力,但能明显促进PC-3细胞在体内的增殖能力。并能明显提高PC-3细胞在体内外的侵袭及发生转移的能力。3.肝素酶1过表达可以促进PC-3细胞在骨组织内的生长,同时也可以提高PC-3细胞诱导破骨细胞形成的能力,增加破骨细胞的活性,从而促进PC-3细胞对骨组织的破坏作用。因此肝素酶1可能是前列腺癌骨转移治疗的一个潜在靶点。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 肿瘤骨转移研究概况
• 第二部分 肝素酶的研究概况
• 正文
• 实验一 肝素酶1 过表达前列腺癌细胞的建立及鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验
• 实验二 肝素酶1 对前列腺癌细胞增殖及侵袭性的影响
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 肝素酶1 对前列腺癌细胞骨破坏作用的影响
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 个人简历和研究成果
• 致谢