CCK-8对LPS诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞MnSOD基因表达的影响

论文摘要

目的:胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）是一种重要的神经调节肽。CCK在体内存在多种活性片段如4肽、8肽、33肽、39肽和58肽等,其中八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide,CCK-8）是其最主要的活性形式。CCK通过其受体发挥调节作用,CCK受体属于G蛋白藕联受体,根据其亲和力以及生物学功能不同,CCK受体分为A、B两种亚型。近年来研究显示,CCK-8及其受体在哺乳类动物体内分布十分广泛。已有文献报道,CCK-8可缓解失血性休克,在内毒素血症患者的血液中CCK-8含量显著升高。此后本室的系列研究证实,内、外源脑肠肽CCK-8确实具有抗内毒素休克（endotoxin shock,ES）作用,可减轻ES发生早期的肺循环和体循环血流动力学紊乱,其机制与调节氧化应激有关。在ES发病过程中,一方面脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）所导致的氧化应激,产生大量的超氧阴离子（O-·2）;另一方面诱导包括血管平滑肌细胞（VSMC）在内的机体多种细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达,产生大量的一氧化氮（NO）,NO和O-·2形成过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。NO、O-·2以及ONOO-参与启动机体氧化应激、介导ES发病过程中肺循环和体循环血管反应性异常改变,因此,O-·2的产生和清除机制研究是十分重要的。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是机体清除O-·2唯一的特异性酶,可使体内的O-·2维持在一定水平。目前,在真核细胞中发现有3种SOD:分布于细胞浆的CuZn SOD,分布于线粒体的MnSOD和分泌到细胞外的EC SOD,其中MnSOD是一种诱生型酶,多种因素如氧化应激、肿瘤坏死因子和LPS等,都可诱导MnSOD表达增加。我们已往的研究结果显示,VSMC存在CCK-8受体,CCK-8对LPS诱导的培养血管内皮细胞SOD活性变化具有一定的调节效应,CCK-8作用的靶点可能是血管SOD和O-·2的生成系统。然而,CCK-8调节血管SOD活性变化的机制尚不清楚。由于MnSOD是诱生型酶且分布在与氧化应激发生密切相关的线粒体,探索CCK-8对LPS诱导MnSOD基因表达的影响及其信号转导机制如受体机制是必要的。本实验拟探讨CCK-8对LPS诱导血管平滑肌细胞MnSOD基因表达的影响,以阐明CCK-8抗ES作用的分子机制。方法:选用雄性、健康Wistar大鼠（120±20g）,无菌条件下分离大鼠胸主动脉,用贴块法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞（TASMCs）,传代至对数生长期（实验用58代）,调整细胞密度为每瓶1×107,加入无血清DMEM培养液以及不同处理因素,检测MnSOD mRNA的表达情况。实验程序:1、分别用0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L LPS以及生理盐水孵育TASMCs 4h,用0.1mg/L LPS孵育TASMCs 2h、4h、8h,检测MnSOD mRNA表达变化,以观察LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达的时效与量效关系。2、用0.1mg/L LPS分别和10-6、10-8、10-10mol/L CCK-8共同处理细胞4h,检测MnSOD mRNA表达变化,以观察CCK-8对LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达的影响。3、在前述实验结果的基础上,选择CCK-8、LPS各一个剂量和一个时间点,CCK-8+LPS与丙谷胺（Pro,CCK受体非特异性阻断剂）、CR-1409（CCK-A受体特异性阻断剂）或CR-2945（CCK-B受体特异性阻断剂）处理细胞,另设Pro、CR-1409、CR-2945对照组,检测MnSOD mRNA表达变化,研究CCK-8对LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达影响的受体机制。用RT-PCR方法检测MnSOD基因表达,用江苏捷达凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析,用MnSOD与β-actin的吸光度比值代表MnSOD mRNA相对表达水平。数据用均数±标准差（x±s）表示,用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,组间比较行单因素方差分析（one-way ANOVA）,有显著差异者进一步用最小显著差法（LSD）进行两两比较,以P<0.05为有统计学意义。结果:1、在TASMCs存在MnSOD mRNA基础表达;与对照组相比,0.01mg/L、0.1mg/L及1.0mg/L LPS分别孵育细胞4h可剂量依赖性引起MnSOD mRNA表达升高（P<0.05）;在LPS诱导TASMCs MnSOD表达的时效关系中,发现2h就可诱导MnSOD mRNA表达升高（P<0.05）,4h表达达到高峰（P<0.05）,8h持续高表达（P<0.05）。2、10-6、10-8、10-10mol/L CCK-8预先处理TASMCs 30min后加入LPS,MnSOD mRNA表达可不同程度地被抑制,与LPS组相比有显著性差异（P<0.05）;CCK-8的抑制效应具有浓度依赖性（P<0.05）;CCK-8（10-8 mol/L）单独处理细胞可导致TASMCs MnSOD mRNA表达明显下调,与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。3、预先用CR-1409、CR-2945、Pro孵育细胞10min后再给予CCK-8和LPS,CR-1409+CCK-8+LPS和CR-2945+CCK-8+LPS组MnSOD mRNA表达与CCK-8+LPS组相比明显升高（P<0.05）,但仍低于LPS组（P<0.05）,其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409更为显著（P<0.05）;Pro+CCK-8+LPS组则完全翻转了CCK-8的抑制效应。结论:CCK-8对TASMCs MnSOD mRNA的基础表达具有抑制性调节作用;LPS可剂量依赖性诱导TASMCs MnSOD mRNA表达上调,MnSOD mRNA的表达高峰开始于LPS作用后4h左右;CCK-8可浓度依赖性抑制LPS诱导TASMCs MnSOD mRNA表达,CCK受体介导CCK-8该抑制作用,其中CCK-BR可能起主要作用。

论文目录

• 中文摘要
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• 英文缩写
• 研究论文 CCK-8 对LPS 诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞MnSOD 基因表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述 超氧化物岐化酶在内毒素休克中的保护作用
• 致谢
• 个人简历