酿酒酵母转座标签插入突变体菌株263-H9中高盐胁迫应答基因的探寻

论文摘要

目前,研究高盐等逆境胁迫下细胞的抗逆应答机理成为生命科学的热点之一,各种新的研究技术与研究成果不断涌现。转座标签技术是根据转座子随机引起插入突变的特性而发展起来的正向遗传筛选的新策略,目前应用较多的是以细菌Tn3转座子为基础改造而成的mTn3转座标签系列。mTn3转座子标签属于随机性的转座子标签,适用于大规模探寻功能基因。 本实验室前期工作以酿酒酵母W303-1A为出发菌株,利用转座标签技术,筛选得到61株对高盐胁迫敏感的酿酒酵母突变菌株。其中突变菌株263-H9的转座标签插入点位于GIP2编码框下游840bp、YER053C-A上游167bp的基因间隔区域内。Southern杂交等实验结果表明,263-H9突变体只含一个转座标签。 本文采用KanMX4系统设计引物,分别敲除插入突变体263-H9中与转座标签紧密连锁的YER053C-A与GIP2基因,所得到的缺失突变体分别命名为DW-101与DW-102。梯度生长实验表明,263-H9对1.5mol/L Sorbitol高渗透压胁迫、0.65mol/L高盐胁迫与15℃低温胁迫具有很强的敏感性表型特征,而缺失突变体DW-101与DW-102对上述胁迫条件并不敏感。 随后我们分别对出发菌株W303-1A和突变体263-H9,采用KanMX4系统分别在转座标签插入位点插入G418抗性基因,菌株分别命名DW-100和DW-103。梯度生长实验结果显示,DW-103仍然表现出对多种胁迫条件的敏感表型。但从W303-1A获得的与之相同位点的突变体DW-100,则没有表现出相应的敏感表型。这一实验结果表明263-H9对多种胁迫条件的敏感表型不是由于转座子标签的插入引起的,因为263-H9菌株中仅有一个转座标签,推测可能在转座过程中染色体其他部位发生突变。 为了探寻263-H9真正引起表型突变的突变位点,根据所需筛选标记及接合型,以DW-100和263-H9杂交,得到二倍体菌株W2。梯度生长表型测定结果表明,二倍体菌株的表型与DW-100相同,这表明263-H9的突变位点为隐性,为下一步可以

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 酿酒酵母渗透压胁迫
• 1.1 酿酒酵母渗透压胁迫应答机理
• 1.1.1 渗透压胁迫信号传导途径
• 1.1.1.1 HOG信号传导途径
• 1.1.1.2 PKC信号传导途径
• 1.1.2 渗透压胁迫下的酵母应答过程
• 2 钠离子胁迫应答分子机制
• +胁迫应答功能蛋白'>2.1 Na⁺胁迫应答功能蛋白
• 2.1.1 Ena1p
• 2.1.2 Nha1p
• 2.1.3 Pma1p和Trk1／2p
• 2.1.4 Nhx1p与Vmap
• +胁迫信号传导途径'>2.2 Na⁺胁迫信号传导途径
• 2.2.1 钙调素信号途径
• 2.2.2 PKA信号途径
• 2.2.3 TOR信号途径
• 2.3 盐胁迫下基因的瞬时应答与延迟应答机制
• 3 转座标签的作用机理
• 3.1 转座子及转座子标签
• 3.2 转座子标签及应用
• 3.2.1 Tn3成分和mTn3转座子标签
• 3.3 转座子标签插入位点的鉴定
• 3.3.1 拯救质粒（rescue plasmid）法
• 3.3.2 基于PCR的分离方法
• 3.3.2.1 锚定载体PCR（Vectorette PCR）
• 3.3.2.2 TAIL-PCR与ST-PCR
• 4 展望
• 5 本论文的研究内容
• 第二章 本实验室的前期工作
• 1.1 酿酒酵母插入突变体库的建立
• 1.2 高盐胁迫酿酒酵母敏感型突变体的筛选
• 1.3 转座标签插入点的确定
• 1.4 转座标签数目进一步验证
• 1.4.1 重复测序
• 1.4.2 Southern杂交
• 1.4.3 拯救质粒法
• 1.5 插入突变体的分析
• 第三章 本论文的研究工作
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 分子克隆用酶和试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 微生物学技术
• 1.4.1 菌体的生长
• 1.4.2 菌种的保存
• 1.4.3 梯度生长实验
• 1.4.4 酿酒酵母二倍体细胞的制备
• 1.5 分子生物学方法
• 1.5.1 常规分子生物学方法
• 1.5.2 酵母染色体的提取
• 1.5.3 PCR反应
• 1.5.4 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收
• 1.5.5 限制性核酸内切酶酶切
• 1.5.6 酿酒酵母完整细胞转化法
• 1.5.7 酿酒酵母质粒的提取与扩增
• 1.5.8 基因敲除（Gene knockout）
• 2.结果与讨论
• 2.1 GIP2基因缺失菌株的研究
• 2.1.1 GIP2基因缺失菌株的构建
• 2.1.2 GIP2基因缺失菌株的验证
• 2.1.3 DW-102梯度生长实验
• 2.1.4 讨论
• 2.2 YER053C-A基因缺失菌株的研究
• 2.2.1 YER053C-A基因缺失菌株的构建
• 2.2.2 YER053C-A基因缺失菌株的验证
• 2.2.3 DW-101梯度生长实验
• 2.2.4 讨论
• 2.3 转座标签插入位点的研究
• 2.3.1 DW-100和DW-103菌株的构建
• 2.3.2 DW-100和DW-103菌株的验证
• 2.3.3 DW-100和DW-103菌株梯度生长实验
• 2.3.4 讨论
• 2.4 263-H9和DW-100杂交二倍体的研究
• 2.4.1 263-H9和DW-100杂交二倍体的构建
• 2.4.2 W2菌株的梯度生长实验
• 2.4.3 讨论
• 2.5 利用pHR81酿酒酵母染色体文库探寻263-H9突变位点的研究
• 2.5.1 pHR81酿酒酵母染色体文库的应用
• 2.5.2 H9-001菌株中质粒的反转实验
• 2.5.3 P2-001菌株的构建与梯度生长实验
• 2.5.4 讨论
• 2.6 pHR81-001质粒中酿酒酵母染色体片段的研究
• 2.6.1 pHR81-001质粒中酿酒酵母染色体片段的测序
• 2.6.2 263-H9菌株中PBS2基因与TRK1片段的克隆
• 2.6.3 263-H9菌株中PBS2基因与TRK1片段测序结果
• 2.6.3.1 263-H9菌株中PBS2基因测序结果
• 2.6.3.2 263-H9菌株中TRK1片段测序结果
• 2.6.4 讨论
• 2.6.4.1 测序结果分析
• 2.6.4.2 Pbs2p的功能
• 2.6.4.3 Trk1p的功能
• 2.6.4.4 转座标签与PBS2突变位点的关系
• 3 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表