结直肠癌与错配修复基因的研究

论文摘要

结直肠癌（CRC）是世界范围内高发性恶性肿瘤,居于世界恶性肿瘤发病率的第四位,同时还是居于致死率第二位的恶性肿瘤。目前全世界每年新增结直肠癌病例约875000例。结直肠癌是环境与遗传的多因素作用结果,其致病环境因素包括阳性家族病史、低纤维膳食、吸烟、饮酒等。而高纤维膳食、非甾体类抗炎药、激素替代治疗以及体力活动等都是结直肠癌的保护因素。遗传因素在结直肠癌的发生、发展过程中发挥了十分重要的作用。结直肠癌的发生涉及到多条分子通路的作用,最主要的就是APC-β-连环蛋白- T细胞受体通路和DNA错配修复异常通路。DNA碱基错配修复基因（MMR）是结直肠癌发生中十分重要的一类相关基因,其主要功能是修复DNA复制过程中的单碱基或短序列的错配,在维持基因组的稳定中起到非常重要的作用。目前在人类细胞中已克隆到6个错配修复基因:hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMS1、hPMS2。错配修复基因不仅与遗传性结直肠癌（遗传性非息肉型结直肠癌[HNPCC]）有关,散发性结直肠癌中也有约15%存在着错配修复基因的改变。人们正逐渐意识到人类对疾病的易感性或抵抗力的多样性有着遗传基础。而在基因组范围内筛查DNA序列多样性的技术的发展正在帮助人们提高对这些遗传基础的认识。约90%的人类DNA序列多样性表现为单碱基的改变——单核苷酸多样性。单核苷酸多样性的存在可为人们提供生命科学范畴内大量的遗传信息。目前有大量的研究已经证实,包括APC、HRAS1等在内的许多基因的单核苷酸多态性都与人类结直肠癌的发生相关。因为碱基错配修复基因是维护基因组稳定的关键基因,且MMR基因的突变与HNPCC的发生相关,因此我们考虑错配修复基因的单核苷酸多态性很可能与散发性结直肠癌也存在相关性。由于错配修复基因的单核苷酸多态性与中国人群散发性结直肠癌的相关性还没有确切而系统的报道,而MMR基因中发挥主要功能的是hMLH1和hMSH2两个基因,它们的突变可占到CRC的MMR基因改变的80%。因此我们选择了29个常见的错配修复基因单核苷酸多态性位点（hMLH1基因:17个;hMSH2基因:12个）进行大人群样本的病例-对照研究,这些位点均位于这两个基因的编码区,均为能够导致氨基酸改变的错义突变。共选择了160例中国散发性结直肠癌和150例健康人群对照,采用通过外周血抽提基因组DNA然后进行SNP位点直接测序的方法筛查这些位点在中国人群的发生频率,并进行基因型-表性相关性分析。有26个错配修复基因单核苷酸多态性位点（包括hMSH2基因的全部12个位点）未在中国人群中检测到或次等位基因频率较低。三个hMLH1基因的多态性位点（hMLH1 394G→C, 655A→G, 1151T→A）在中国人群中存在一定的发生频率（8.8-11.2%）。而且这些单核苷酸多态性位点还形成了一些特殊的单倍型组合,其中hMLH1 655A-394C-1151A组合与hMLH1 394G-655G-1151A组合只在散发性结直肠癌样本中发现。而错配修复基因缺陷结直肠癌与非缺陷结直肠癌相比有其独特的分子、病理、临床特征,表现为:微卫星不稳定性、多发于右半结肠、分化程度较低、多为粘液和髓状癌以及明显的癌周和瘤内淋巴细胞浸润。相对于错配修复基因非缺陷结直肠癌,错配修复基因缺陷结直肠癌有着较好的临床预后,并且这种生存优势只与微卫星稳定性相关,而与其他临床、病理分期无关。许多研究已经证实错配修复基因缺陷与非缺陷结直肠癌之间存在着转录水平的mRNA表达差异,但对于转录后水平的情况尚不清楚。而microRNA是近年来新发现的一类长约1925个核苷酸的转录后调控小RNA分子,它可以通过与靶基因mRNA的3’非翻译区的特定互补部位结合而导致翻译抑制或mRNA降解。正因为此,我们选择了microRNA芯片和实时定量PCR技术来检测错配修复基因缺陷与非缺陷结直肠癌在转录后水平的差异。利用结直肠癌病例组织样本和细胞系样本分析了错配修复基因缺陷结直肠癌的转录后调控表达谱,并进一步分析了差异表达的miRNA在结直肠癌发生过程中的病理作用。共发现了8个miRNA在病例组织和细胞系样本中表现出一致性的差异:5个高表达miRNA——miR-21,let-7a,miR-200b,miR-200c,miR-145和3个低表达miRNA——miR-127,miR-155,miR-133b。其中,miR-21在错配修复基因缺陷结直肠癌中高表达,并且在组织和细胞水平的聚类分析中均是最为突出的位点。随后通过生物信息学和实验手段证实癌基因PLAG1是miR-21的靶基因。同时由于PLAG1是IGF2基因的转录调控因子,进而又检测了以上所有组织和细胞样本中的IGF2基因的mRNA表达水平,证实其表达与它的调控因子PLAG1一致。更为重要的是利用细胞和人结直肠癌裸鼠模型进行了一系列体内和体外分析,发现下调PLAG1的表达或上调miR-21的表达可以抑制结直肠癌细胞增殖,并促进其凋亡。随后通过裸鼠模型体内实验还发现,上调错配修复基因非缺陷结直肠癌细胞的miR-21的表达水平后,非缺陷细胞可以表现出现明显的淋巴细胞浸润,而这一般被认为是错配修复基因缺陷结直肠癌的特征。可以认为miR-21正是通过负向调控PLAG1和IGF2基因的表达而影响错配修复基因缺陷结直肠癌的肿瘤生长乃至其预后。本研究第一次证实了癌基因PLAG1是miR-21的靶基因,同时提出miR-21的高表达可能在错配修复基因缺陷结直肠癌的肿瘤生长及预后中发挥着重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 结直肠癌与错配修复基因的研究
• 引言
• 第一部分 错配修复基因单核苷酸多态性与中国人群散发性结直肠癌的相关性研究
• 一、前言
• 二、材料与方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 参考文献
• 小结
• 第二部分 microRNA-21 通过下调癌基因PLAG1 影响错配修复基因缺陷结直肠癌预后
• 一、前言
• 二、材料与方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 参考文献
• 小结
• 附录
• 一、组织基因组DNA抽提方法
• 二、质粒图谱
• 文献综述
• 参考文献
• 论文发表和参加科研工作情况
• 致谢