论文摘要
目的和背景肿瘤抗原的寻找一直是肿瘤免疫学研究中面临的重要课题。Sahin的SEREX（Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries）方法是以机体肿瘤细胞的免疫反应为基础，用肿瘤病人的血清对肿瘤来源的cDNA表达文库进行免疫筛选，以识别能与高滴度IgG抗体反应的分子。该方法从体液免疫的角度寻找肿瘤抗原，为寻找肿瘤抗原提供了一种全新的途径，已应用于许多类型的肿瘤抗原的筛选，发现了一些新的肿瘤排斥抗原，显示出该方法具有良好的应用前景。肝癌，尤其是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）由于较难早期诊断发现，在我国的发病率和死亡率很高，大部分患者都在发现后的一年内死亡。因此，发现新的更具优势的肿瘤抗原用于诊断是急需研究的课题之一。目前，本实验室已经运用SEREX技术鉴定出肝细胞癌相关抗原的编码基因81个。本研究通过采用生物信息学分析对其中9个肝癌相关抗原基因（克隆对应编号：X7、X21、X64、X28、X41、X37、X87、X33、X53）的结构功能、细胞定位以及可能编码的蛋白质等进行预测，发现所编码最可能的蛋白与肝癌关系较为密切，分别包括DDX41即RNA解螺旋酶DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）box polypeptide 41、PDK2即丙酮酸脱氢酶激酶同工酶2（pyruvate dehydrogenase kinase，isoenzyme2）、KRT23即角蛋白23 （keratin23）、AHSG即a2-HS糖蛋白（alpha-2-HS-glycoprotein）、AHSA1即热休克蛋白P90的三磷酸腺苷酶激活子（activator of heat shock 90kDa protein ATPase）、SEPP1即血浆硒蛋白1（selenoprotein P，plasma，1）、SPP1即人类骨桥蛋白（Human osteopontin）、RPL17即核糖体蛋白17（ribosomal protein L17）、FTL即铁蛋白轻链（ferrifin，light polypeptide）等9种肝癌相关抗原，参与肝细胞的分化、衰老、凋亡、代谢及信号转导等等。对该9个肝癌相关抗原基因表达的抗原蛋白在HCC患者、慢性肝炎患者以及正常人血清中相应自身抗体的检测和分析，对其能否作为肝细胞癌诊断的标志物进行评价，为HCC的诊断和治疗提供候选基因，为HCC疫苗的研制及免疫效果监测打下基础，也为探讨HCC发生发展的分子机理提供研究依据。方法生物信息学分析部分：利用生物信息学技术对筛选出的其中9个肝癌相关抗原基因的结构功能、细胞定位以及所编码的蛋白质等进行预测。试验部分：1．将我们实验室用SEREX的方法筛选出来的含有不同肝癌相关抗原基因的阳性单克隆噬菌体直接转染大肠杆菌，铺板后转膜。2．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IP7G）诱导蛋白质表达，3％脱脂奶粉封闭。3．待检测血清的预吸收。4．转有抗原蛋白的膜与预吸收过的血清反应后，结合1∶2000稀释的二抗，在二氨联苯胺（DAB）的作用下显色，抗原抗体复合物处呈现紫蓝色。5．分析结果。结果通过生物信息学分析发现，该9个HCC相关抗原基因（X7、X21、X64、X28、X41、X37、X87、X33、X53）编码最可能的蛋白分别是DDX41即RNA解螺旋酶DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）box polypeptide 41、PDK2即丙酮酸脱氢酶激酶同工酶2（pyruvate dehydrogenase kinase，isoenzyme 2）、KRT23即角蛋白23（keratin23）、AHSG即a2-HS糖蛋白（alpha-2-HS-glycoprotein）、AHSA1即热休克蛋白P90的三磷酸腺苷酶激活子（activator of heat shock 90kDa protein ATPase）、SEPP1即血浆硒蛋白1（selenoprotein P，plasma，1）、SPP1即人类骨桥蛋白（Human osteopontin）、RPL17即核糖体蛋白17（ribosomal protein L17）、FTL即铁蛋白轻链（ferritin，light polypeptide），与肿瘤的发生、浸润以及转移有着不同程度的联系。HCC相关抗原角蛋白23（KRT23）、a2-HS糖蛋白（AHSG）、核糖体蛋白17（RPL17）、铁蛋白轻链（FTL）、RNA解螺旋酶（DDX41）在肝细胞癌患者血清中相应抗体阳性率依次为76.4％（42／55）、81.8％（45／55）、78.2％（43／55）、78.2％（43／55）、91.0％（50／55），慢性肝炎患者血清中的阳性率为60.0％（18／30）、53.3％（16／30）、76.7％（23／30）、56.7％（17／30）、96.7％（29／30），正常人血清阳性率为43.3％（13／30）、46.7％（14／30）、33.3％（10／30）、43.3％（13／30）、76.7％（23／30）；三种血清抗体阳性率有显著性差别的为角蛋白23（KRT23）（x2=9.27，P=0.0097）、a2-HS糖蛋白（AHSG）（x2=12.99，P=0.0015）、核糖体蛋白17（RPL17）（x2=19.28，P＜0.0001）、角蛋白23（KRT23）（x2=6.88，P=0.0087）、铁蛋白轻链（FTL）（x2=10.89，P=0.0043）、RNA解螺旋酶（DDX41）（xs2=6.44，P=0.0399），其中肝癌与正常人阳性率有显著性差别的为角蛋白23（KRT23）（x2=9.27，P=0.002）、a2-HS糖蛋白（AHSG）．（x2=11.30，P=0.001）、核糖体蛋白17（RPL17）（x2=16.63，P＜0.0001）、铁蛋白轻链（FTL）（x2=10.49，P=0.001）；其他几个相关抗原包括人类骨桥蛋白（SPP1）、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶2（PDK2）、热休克蛋白P90的三磷酸腺苷酶激活子（AHSA1）、血浆硒蛋白1（SEPP1）检测的阳性率在三种血清中阳性率无差别。四个抗原（KRT23、AHSG、RPL17、FTL）联合检测中，并联试验时，灵敏度达到98.2％，而特异度却下降到了65.3％；串连试验时，灵敏度下降到了62.7％，而特异度升高到90.0％。结论生物信息学分析是一种行之有效的了解未知基因的较好方法，可以对未知基因的结构、功能以及所编码蛋白的功能有很好的预测。KRT23、AHSG、RPL17、FTL、DDX41等五个肝细胞癌相关抗原在三种血清中的阳性率有显著性差别，其中KRT23、AHSG、RPL17、FTL在肝癌患者血清中的阳性率明显高于正常人血清，有可能成为HCC血清学早期诊断的标志物之一。该四个抗原联合检测时，发现灵敏度和特异度有一定提高，提示为肝癌的早期诊断提供更好的标志物检测方法。