NADPH氧化酶参与盐胁迫诱导的烟草悬浮细胞活性氧的产生

论文题目: NADPH氧化酶参与盐胁迫诱导的烟草悬浮细胞活性氧的产生

论文类型: 硕士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 张锦广

导师: 陈珈

关键词: 氧化酶,盐胁迫,悬浮细胞,活性氧

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 土壤盐渍化严重威胁着农作物的产量。很多研究表明盐胁迫对植物细胞的损伤涉及到活性氧类物质,生长在高盐环境下的植物比正常生长的植物会积累更多的活性氧。目前,盐胁迫下活性氧的来源还不是很清楚,考虑到活性氧在植物逆境下的重要作用,盐胁迫产生活性氧的来源越来越受到人们的重视。先前的研究表明,一种质膜结合的NADPH氧化酶涉及到植物病原物相互作用过程中活性氧的释放,那么,NADPH氧化酶是否参与盐胁迫下活性氧的生成呢? 本研究以烟草悬浮细胞（BY-2）为试验材料,通过不同浓度的NaC1处理,阐明盐胁迫下细胞的生长状况,发现盐胁迫抑制细胞生长,在200mMNaC1下,细胞已经停止生长。苔盼蓝染色表明盐胁迫可以引起细胞死亡,盐胁迫处理24小时引起细胞基因组发生降解。DAB染色和硫酸钛法测定证明盐胁迫可以诱导细胞迅速产生H2O2,产生的阶段主要是在前60分钟。通过使用NADPH氧化酶的抑制剂-DPI处理,发现NADPH氧化酶参与盐胁迫诱导细胞活性氧的释放。DCFH-DA荧光染色证明ABA也可以诱导细胞产生H2O2,产生的途径可能也是通过NADPH氧化酶,证明ABA信号途径的普遍性。 使用RT-PCR证明NADPH氧化酶基因受盐诱导,Western-blot方法证明NADPH氧化酶基因受盐和ABA的诱导,而在通常状况下NADPH氧化酶的表达很少。利用农杆菌介导的方法获得超表达NADPH氧化酶基因的悬浮细胞,对超表达的细胞进行耐盐性分析,发现超表达的细胞对盐敏感。

论文目录:

第一部分 文献综述

第一章 植物耐盐性研究进展

1.1 盐胁迫对植物的伤害

1.2 植物对盐胁迫的适应

1.3 盐胁迫和细胞凋亡

1.4 活性氧的来源

1.5 活性氧信号转导途径

第二章 NADPH氧化酶研究进展

2.1 NADPH氧化酶的结构

2.2 NADPH氧化酶的功能

2.2.1 在植物抗病反应中

2.2.2 激活基因和依赖转录的防卫反应

2.2.3 在植物生长中的作用

2.2.4 传递细胞间信号的作用

2.3 NADPH氧化酶的活性调节

2.3.1 磷酸化调节

2.3.2 ABA的调节作用

2.3.3 NO的调节作用

2.3.4 金属离子的调控作用

2.3.5 G蛋白Rac的调节作用

2.3.6 渗透调节作用

2.3.7 乙烯和pH值的调节作用

2.4 NADPH氧化酶的诱导表达

2.5 NADPH氧化酶的抑制剂

本研究的目的与意义

第二部分 研究报告

第一章 细胞耐盐性分析及盐胁迫诱导烟草悬浮细胞活性氧的产生

3.1 实验材料

3.1.1 烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞BY-2(Bright Yellow-2)

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.2 常用培养基和溶液的配制

3.2.1 MS培养基

3.2.2 主要溶液的配制

3.3 实验方法

3.3.1 悬浮细胞的培养

3.3.2 细胞活力鉴定

3.3.3 细胞胁迫处理

3.3.4 细胞苔盼蓝染色

3.3.5 细胞死亡计数

3.3.6 细胞基因组提取

3.3.7 细胞基因组电泳分析

3.3.8 细胞鲜重和干重测量

3.3.9 细胞DAB染色

3.3.10 H_2O_2的测定

3.3.11 细胞色素C法测NADPH氧化酶的活性

3.3.12 RNA提取(Trizol法)

3.3.13 cDNA第一链的合成

3.3.14 RT-PCR

3.3.15 细胞DCFH-DA染色

3.3.16 原生质体制备

3.4 实验结果

3.4.1 细胞活力鉴定

3.4.2 盐胁迫细胞苔盼蓝染色

3.4.3 盐胁迫引起细胞基因组降解

3.4.4 盐胁迫对细胞生长的影响

3.4.5 盐胁迫对细胞死亡率的影响

3.4.6 盐胁迫诱导悬浮细胞H_2O_2产生的DAB染色

3.4.7 显微镜观察细胞DAB染色

3.4.8 抑制剂DPI对盐胁迫下H_2O_2产生的影响

3.4.9 TRISZOL法提取细胞总RNA

3.4.10 盐胁迫下细胞NADPH氧化酶基因的表达

3.4.11 盐胁迫诱导H_2O_2产生的测定

3.4.12 细胞色素C法测NADPH氧化酶的活性

3.4.13 ABA诱导悬浮细胞产生H_2O_2的DC-FH染色

3.4.14 FDA染色鉴定原生质体活性

3.4.15 ABA诱导原生质体产生H_2O_2的DC-FH染色

3.4.16 ABA处理细胞死亡计数

结果：

讨论：

第四章 超表达NADPH氧化酶基因的烟草悬浮细胞耐盐性分析

4.1 实验材料

4.2 常用溶液配置

4.2.1 碱裂解法质粒提取溶液的配制

4.2.2 YEB培养基

4.2.3 提膜溶液

4.2.4 蛋白含量测定溶液

4.2.5 Western所需试剂

4.3 实验方法

4.3.1 含有pBI-NAO质粒的农杆菌获得

4.3.2 农杆菌质粒提取(碱裂解法)

4.3.3 农杆菌质粒PCR鉴定和酶切鉴定

4.3.4 农杆菌介导的转基因

4.3.5 转基因细胞的鉴定

4.3.6 细胞质膜蛋白粗提

4.3.7 蛋白含量的测定

4.3.8 Western-blot

4.3.9 细胞鲜重和干重测量

4.3.10 MDA含量测定

4.3.11 脯氨酸含量测定

4.4 实验结果

4.4.1 含有pBI-NAO质粒的农杆菌的说明

4.4.2 农杆菌质粒PCR鉴定

4.4.3 农杆菌质粒酶切鉴定

4.4.4 卡那板筛选抗性愈伤

4.4.5 抗性愈伤的继代

4.4.6 基因组DNA鉴定转基因愈伤

4.4.7 Western-blot

4.4.8 细胞鲜重和干重测量

4.4.9 细胞死亡计数

4.4.10 转基因细胞MDA含量测定

4.4.11 转基因细胞脯氨酸含量测定

结果

讨论

参考文献

致谢

个人简历

发布时间: 2005-07-22

参考文献

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• [2].表达NADPH和底物供应的关键基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响[D]. 张美玲.江南大学2018
• [3].拟南芥微丝骨架动态调节盐胁迫诱导的NADPH氧化酶活性和活性氧的产生[D]. 刘尚刚.山东农业大学2011
• [4].20-羟二十烷四稀酸（20-HETE）经NADPH氧化酶衍生的活性氧途径引起乳鼠心肌细胞钙超载效应[D]. 李卫.东北师范大学2010
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