重组大肠杆菌化学裂解法的建立及其对重组蛋白纯化的影响

论文摘要

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 （CTLA-4）是活化T淋巴细胞表面的一种与免疫信号传递有关的膜蛋白分子,由特征性的IgV胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。CTLA-4能与CD28分子竞争结合抗原提呈细胞（APC）上的B7分子,对免疫应答起负调节作用。单独的IgV胞外区能与B7分子结合,但不能传递负调节信号,反而能促进其融合抗原向APC提呈,有可能成为一种新型分子免疫佐剂。本研究利用已构建的表达不溶性CTLA-4-VP2S融合蛋白的重组大肠杆菌（E.coli）为模型,在预试验基础上,用含不同浓度佳美洗衣粉的5种化学裂解液,探索对重组菌的最佳裂解条件。实验结果表明,含1.5%佳美洗衣粉的TST1（0.1%Triton X-100, 100mM NaCl, 25mM Tris-HC1,pH8.0）,在4℃条件下孵育15min,裂解效果与超声波裂解法相当。在此基础上进行携带相同质粒的不同菌株和携带不同质粒的相同菌株进行裂解试验,结果表明对不同菌株的裂解效果存在明显差异,而裂解效果与所携带质粒无关。利用建立的方法裂解pGEX-VP72S和pQE-CTLA-4-VP2S重组大肠杆菌,研究化学裂解对可溶性GST-VP72S融合蛋白和不溶性CTLA-4-VP2S融合蛋白纯化的影响。结果表明,用GST亲和层析法从重组菌裂解提纯可溶性GST-VP72S融合蛋白的纯度达93%,回收率达42.6%;用离心法收集菌体裂解物中的包涵体,经过2M尿素溶液离心洗涤后,包涵体的纯度可达67.4%,经过尿素变性后进行Protino Ni-TED2000 packed columns亲和层析,获得的重组蛋白的纯度可达90%以上,回收率达37.8%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述 重组大肠杆菌包涵体分离方法的研究进展
• 参考文献
• 研究内容一：重组大肠杆菌化学裂解法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 研究内容二：化学裂解对重组蛋白纯化的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 小结
• 致谢