论文摘要
癌症依然是当今危害人类的第一杀手。放射治疗和化学药物治疗是治疗肿瘤以及防止肿瘤复发的主要手段。而放化疗通常会带来骨髓造血和免疫功能抑制等副作用。因此深入研究治疗化疗后骨髓抑制的药物在癌症治疗中具有重要的意义。我们的实验模型是使用5-氟尿嘧啶（5-Fu）一次性注射小鼠,导致其骨髓抑制和随后的再生修复。5-Fu注射后小鼠的外周血细胞数量和骨髓细胞数量先下降,到第7天降至最低,随后逐渐回升,到第14天恢复至正常水平。此血象变化与人受5-Fu化疗后血象变化规律一致,是研究骨髓再生机理的经典动物模型。应用全基因组表达芯片技术,我们对小鼠受5-Fu化疗后14天内骨髓再生过程中骨髓全基因组表达谱作了系统研究,发现众多基因的表达呈现显著的先上升后下降的趋势。我们假设这些基因通过改变其自身的表达水平发挥对骨髓再生,即化疗后骨髓恢复的调节作用。抵抗素（Resistin,简称Retn）是近年来新发现的一个富含半胱氨酸的分泌型多肽,属于抵抗素样分子家族,由于具有拮抗胰岛素的作用而得名。在啮齿类动物中,抵抗素主要由脂肪细胞特异性表达和分泌。它不仅是联系肥胖症和Ⅱ型糖尿病的重要蛋白,而且具有多种生物学功能,如干扰肝细胞的糖原代谢、促进内皮细胞增殖迁移、促进血管生长以及减少心梗面积等。我们的骨髓全基因组表达芯片显示抵抗素Resistin的表达呈现显著的先上升后下降的趋势,因此我们预测Resisitin的基因表达与骨髓损伤和修复相关,它可能是一条保护骨髓或者促进骨髓损伤后再修复的天然基因。本课题拟制备小鼠抵抗素Resistin重组蛋白,研究其对小鼠骨髓造血的调控作用和治疗骨髓抑制的药效学作用。本研究从该基因的克隆开始,首先构建了真核表达重组质粒,使用电脉冲方法,将质粒转染到正常小鼠的胫前肌启动在体表达,初步观察Resistin对小鼠的作用。为了进一步考察Resistin对小鼠骨髓的影响,我们构建了原核表达重组质粒,在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达,经过蛋白变性与复性后,经阳离子交换层析过柱纯化,通过Western Blot鉴定了该重组蛋白,并测定重组蛋白的生物学活性和内毒素含量。将重组蛋白注射正常小鼠,研究其对骨髓造血的调控作用。本研究的主要方法和结果如下:收集小鼠5-Fu抑制期骨髓细胞,抽提总RNA,经RNA的反转录（RT）得到小鼠基因组cDNA,通过cDNA的聚合酶链式反应（PCR）扩增基因mResistin的编码序列,琼脂糖凝胶电泳验证片段大小约345 bp大小,将回收产物克隆到真核表达载体phCMV1中构建真核表达重组质粒phCMV1-mResistin,测序发现有2个碱基发生突变,经二次PCR纠正突变后重新酶切、连接,构建真核表达重组质粒phCMV1-mResistin,测序正确后进行质粒大量制备并去除内毒素,测定内毒素含量不超过1 EU/μg质粒。通过电转技术在肌肉细胞中表达基因产物,对正常小鼠进行药效学研究,观测到正常小鼠转染基因mResistin后,实验组较对照组（phCMV1空质粒转染）小鼠的骨髓细胞数、外周血白细胞数以及骨髓细胞处于S期的百分数均显著增高,提示基因mResistin可能促进骨髓造血。随后通过PCR方法从真核表达重组质粒phCMV1-mResistin中克隆得到小鼠抵抗素Resistin成熟肽目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳验证片段大小约285 bp大小,将回收产物克隆到原核表达载体pET28a（+）空质粒中构建重组质粒pET28a（+）-mResistin,转化到原核表达宿主菌BL21（DE3）后,酶切方法筛选鉴定,测序证明与Resistin成熟肽基因序列一致。经过蛋白表达的优化,确定最佳的诱导条件为42℃诱导8小时,Kana浓度为100μg/mL的LB培养基,IPTG浓度为1 mmol/L。用IPTG诱导1 L菌液,蛋白主要以包涵体形式存在,分子量大小10.4 kDa。离心获得菌体,经超声和溶菌酶双重破菌后,洗涤包涵体,用6 M盐酸胍进行包涵体变性,在pH6.0的复性液中进行稀释复性,复性后的蛋白溶液经Sp-Sepharose阳离子交换层析后获得目的蛋白溶液。BSA蛋白定量法测得其浓度可达0.548 mg/mL,SDS-PAGE鉴定结果表明重组蛋白纯度大于95%,计算蛋白得率,1 L初始菌液获得了7.0 mg的重组蛋白。测定重组蛋白的内毒素含量和生物学活性,用显色基质鲎试剂盒测定蛋白的内毒素含量小于1 EU/μg,通过骨髓造血干（祖）细胞体外集落培养（CFU）检测表明mResistin蛋白具有体外促进小鼠造血干（祖）细胞增殖及分化的活性。用重组蛋白注射正常小鼠进行药效学研究,结果发现mResistin重组蛋白显著升高正常小鼠骨髓细胞总数,提示mResistin具有促进骨髓再生功能。mResistin用药后注射5-Fu（300 mg/kg）,小鼠对骨髓抑制药物5-Fu的敏感性显著增加,死亡率达到100%,提示mResistin具有促进更多骨髓细胞进入细胞周期的功能从而加重机体损伤;而5-Fu（300 mg/kg）注射后给予mResistin蛋白显著降低小鼠死亡率,提示外源性mResistin在骨髓损伤后的修复中具有促进作用。本课题为进一步研究Resistin在调节骨髓造血系统的作用和作用机理奠定了实验基础。