慢病毒介导的转化生长因子β不敏感肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的构建及鉴定

论文摘要

目的肿瘤细胞分泌大量的转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）,具有潜在的免疫抑制功能。因此,肿瘤细胞能够逃避宿主细胞的免疫监视而进展和转移。肿瘤分泌的TGF-β抑制宿主的免疫系统,特别是细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）对其的识别杀伤。鉴于TGFβ在肿瘤发展过程中的负性免疫调节作用,使CTL对TGFβ失去敏感性可以恢复其对肿瘤的杀伤活性。因此,TGF-β是抗肿瘤治疗的重要靶点之一。肿瘤免疫治疗大多着眼于增强机体免疫系统的抗肿瘤活性,所以针对肿瘤免疫抑制的免疫疗法是很有前景的。肿瘤特异性CTL是体内抗肿瘤免疫最为有效的效应细胞,但其激活需要抗原呈递细胞（antigen-presenting cells,APC）处理并呈递相应的抗原。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是目前已知功能最强的APC,可以激活初始T细胞（naive T cell）和记忆性T细胞。DC可提供T细胞活化所需的共刺激信号,在体内外诱导CTL的生成。肿瘤组织匀浆、细胞裂解物包含全部抗原信息,用其致敏DC细胞,体外可以激发T细胞大量增殖,产生肿瘤特异性CTL。鉴于TGFβ在肿瘤发展过程中的负性免疫调节作用,使CTL对TGFβ失去敏感性可以恢复其对肿瘤的杀伤活性,用含有TβRⅡDNglytk质粒的慢病毒来感染肿瘤特异性CTL使其对TGFβ失去敏感性后发挥抗肿瘤效应。本实验中将HSV-tk引入,当肿瘤细胞被消除或CTL量过大时,给予适量GCV能够使这些CTL自杀,避免其产生毒副作用。方法我们用TOPO技术将显性负相TGF-βⅡ型受体（dominant negative TGFβtypeⅡreceptor,TDRⅡDN）与单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virusthymidine kinase,HSV-tk）连接起来后转入慢病毒载体,构建表达TβRⅡDNglytk的慢病毒,并构建TRANSglytk为对照;用DC、肿瘤组织匀浆、T淋巴细胞培养出肿瘤特异性CTL;然后以慢病毒为载体将TβRⅡDNglytk基因转染到肿瘤特异性CTL,从而去除了TGF-β对肿瘤特异性CTL的抑制作用,恢复CTL对肿瘤的识别杀伤;最后通过荧光抗体染色,Western-blot,MTT,流式细胞术等方法对其进行了分析、鉴定。Smad2/3磷酸化是TGFβ活化的直接结果,是TGFβ信号传导通路的关键点所在,TGFβ处理过的CTL若P-Smad2/3表达缺失则认为是TGFβ信号传导通路被阻断,细胞对TGFβ不敏感。Western blot分析不同类型CTL磷酸化的Smad2/3（P-Smad2/3）量可以鉴别其对TGFβ的敏感性。表达TRANSglytk的CTL为对照。结果1利用重组PCR技术连接TβRⅡDN（TRANS）与HSV-tk连接起来转入慢病毒载体,测序验证正确,成功构建了表达TβRⅡDNglytk及对照TRANSglytk的慢病毒。2外周血来源PBMC,在IL-4、GM-CSF诱导下,可得到DC。负载肿瘤抗原DC,激活T细胞,可使其大量扩增,得到肿瘤特异性CTL。3以慢病毒为载体可将TβRⅡDN-tk基因转染到肿瘤特异性CTL,Anti-v5-TIFC荧光抗体染色证实了转染成功,Western-blot检测P-Smad2/3蛋白表达明显减少,证明转染TβRⅡDNglytk基因后TGF-β信号传导通路阻断,对正常表达的TGF-βⅡ型受体产生了竞争性抑制作用。4转染TβRⅡDN-tk,TRANS基因对淋巴细胞表型,凋亡,周期无明显影响。GCV对携带HSV-tk自杀基因的TGF-β不敏感CTL杀伤活性结果表明GCV能够杀死经慢病毒转染后表达HSV-tk的细胞,而未转染组细胞几乎无死亡。结论对TGF-β不敏感肿瘤特异性CTL培养成功及鉴定表明:这一方法在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用前景,为肿瘤的过继免疫治疗提供了又一新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 慢病毒介导的转化生长因子β不敏感肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的构建及鉴定
• 对象和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 削弱TGF-β负性免疫调节作用在进展期肿瘤治疗中的应用
• 综述参考文献
• 致谢