高等植物长链脂肪醇氧化酶初步研究

论文摘要

一些酵母在以烷烃或长链脂肪酸为碳源进行生长时,首先利用定位在内质网膜上的ω-氧化系统将烷烃或长链脂肪酸氧化形成羧酸或二羧酸,然后进入β-氧化为生物体生长提供碳源及能量。在ω-氧化中,烷烃或脂肪酸的亚甲基端依次由P450单加氧酶、产生过氧化氢的长链脂肪醇氧化酶（Long-chain fatty alcohol oxidase, FAO）及醛脱氢酶氧化分别生成ω-醇、ω-醛及ω-脂肪酸。研究表明,当酵母利用烷烃或长链脂肪酸为碳源时,催化第一步反应的P450单加氧酶是由CYP52基因家族的成员编码的。已经发现多种植物中存在与CYP52同源的基因,且这一类基因大都和植物的抗病抗逆相关。既然在植物中存在类似于酵母中催化ω-氧化第一步的酶,那么在植物中是否存在类似的FAO?其功能又是什么?本研究主要对拟南芥、百脉根及水稻这三种高等植物中的FAO基因进行了基因序列分析、生化功能及生理功能等方面的初步研究。首先利用酵母FAO的氨基酸序列对拟南芥全基因组序列进行搜索,发现四个与FAO同源性较高的基因,分别是AtFAO1（At1g03990）、AtFAO3（At3g23410）、AtFAO4a（At4g19380）和AtFAO4b（At4g28570）。通过RT-PCR方法获得了AtFAO1 （At1g03990）, AtFAO4a （At4g19380）和AtFAO4b （At4g28570）三个基因的全长ORF。接着利用拟南芥的四个FAO全长氨基酸序列搜索百脉根的EST数据库,得到一个EST序列。根据该序列设计引物并以百脉根顶端cDNA为模板进行3’-RACE,得到一个1.4 kb的片段。以该片段为探针筛选百脉根cDNA文库并最终得到了LjFAO1基因。利用PCR方法得到全长为3.6 kb的LjFAO1基因基因组DNA。另外还通过cDNA文库筛选得到了百脉根中的LjFAO2。再利用拟南芥中FAO的氨基酸序列对水稻基因组进行tblastn及blastp搜索。结果显示在水稻基因组中存在四个FAO基因,一个位于2号染色体,命名为OsFAO1;另外三个在10号染色体上,分别命名为OsFAO2、OsFAO3和OsFAO4。对上述的10个FAO基因做序列分析发现:存在于高等植物中的FAO基因大多为三个外显子和两个内含子的基因结构;其氨基酸序列都具有酵母FAO蛋白的五个保守结构域。进化分析表明FAO在单双子叶植物中的分化是在单双子叶植物分化之后。将得到的基因序列用原核表达系统进行蛋白表达后检测酶活,结果只有AtFAO4b和LjFAO1两个蛋白能够催化长链脂肪醇的氧化。酶动力学分析表明,AtFAO4b和LjFAO1都具有底物特异性。利用Ni-NTA柱纯化这两个蛋白后进行电泳检测,结果都得到了单一的蛋白条带。对AtFAO3和AtFAO4b的表达模式进行了RT-PCR检测。结果显示:AtFAO3和AtFAO4b基因在整株中均有表达,但是其表达水平在不同组织部位存在差异;AtFAO3和AtFAO4b对低温胁迫响应不同。对AtFAO3和AtFAO4b的T-DNA插入突变体进行病原菌接种,发现病原菌感染对AtFAO3的T-DNA插入突变体生长没有影响,而AtFAO4b的T-DNA插入突变体表现出易感性增高。这些结果说明AtFAO3和AtFAO4b虽然都能够催化长链脂肪醇氧化,但是它们在植物体内的功能不相同。AtFAO4b可能在拟南芥脂肪代谢及细胞壁发育中具有重要的作用。RT-PCR分析显示LjFAO1在整株中都有表达,但是在顶端表达水平最高而在果荚中表达量最低。在8日龄的百脉根幼苗的顶端和子叶中,LjFAO1表达水平可被低温诱导下调。对公共数据库中水稻FAO基因的表达模式数据进行分析发现OsFAO1和OsFAO4的表达水平较高,OsFAO2和OsFAO3的表达水平较低,而且四个基因对逆境处理有不同的响应。上述结果说明,在高等植物中普遍存在FAO基因,拟南芥、百脉根与水稻的研究表明该类基因可能与植物的抗病抗逆相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩写列表
• 第一章. 酵母和植物中ω-氧化研究进展
• 1.1 酵母中的ω-氧化研究进展
• 1.1.1 酵母CYP52 的特性与功能
• 1.1.2 酵母长链脂肪醇氧化酶研究进展
• 1.1.3 酵母脂肪醛脱氢酶研究进展
• 1.2 植物中的长链脂肪酸ω-氧化研究进展
• 1.2.1 植物中CYP52 同源基因的研究进展
• 1.2.2 植物中的长链脂肪醇氧化酶基因研究进展
• 1.3 本文的目的与意义
• 第二章. 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 大肠杆菌菌株
• 2.1.3 常用载体
• 2.1.4 cDNA 文库
• 2.1.5 常用耗材
• 2.1.6 引物序列
• 2.1.7 序列分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物材料的培养
• 2.2.2 植物基因组DNA 的提取
• 2.2.3 植物总DNA 的制备
• 2.2.4 PCR 反应
• 2.2.5 PCR 产物克隆及鉴定
• 2.2.6 基因组Southern blotting
• 2.2.7 cDNA 文库的筛选
• 2.2.8 蛋白的制备
• 2.2.9 酶活性检测（1ml 体系）
• 2.2.10 植株的逆境处理
• 2.2.11 拟南芥遗传转化及筛选
• 第三章. 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆及序列分析
• 3.1 前言
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆
• 3.2.2 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因序列分析
• 3.2.3 Southern Blotting 检测百脉根LjFAO 拷贝数
• 3.2.4 高等植物长链脂肪醇氧化酶的进化分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 LjFAO 基因的拷贝数检测及序列分析
• 3.3.2 水稻中FAO 基因结构的预测
• 3.3.3 水稻FAO 基因的克隆
• 3.4 本章小结
• 第四章. 高等植物长链脂肪醇氧化酶的生物化学功能研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 AtFAO4b 蛋白的原核表达及纯化
• 4.2.2 AtFAO4b 蛋白的酶活测定
• 4.2.3 LjFAO1 蛋白的原核表达与纯化
• 4.2.4 LjFAO1 蛋白的酶活测定
• 4.2.5 截短及点突变LjFAO1 蛋白研究
• 4.3 讨论
• 4.3.1 保守结构域对LjFAO1 蛋白酶活性的影响
• 4.3.2 底物浓度对酶活性检测的影响
• 4.3.3 水稻FAO 基因的原核表达
• 4.4 本章小结
• 第五章. 高等植物长链脂肪醇氧化酶生理功能研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 AtFAO3 和AtFAO4b 的启动子元件分析
• 5.2.2 AtFAO3 和AtFAO4b 的芯片数据分析
• 5.2.3 AtFAO3 和AtFAO4b 的表达
• 5.2.4 AtFAO3 和AtFAO4b 对冷害处理的响应
• 5.2.5 AtFAO3 和AtFAO4b 的T-DNA 插入突变体鉴定
• 5.2.6 AtFAO3 和AtFAO4b 的T-DNA 插入突变体的表型
• 5.2.7 RT-PCR 确定LjFAO1 基因的表达模式
• 5.2.8 LjFAO1 对逆境的响应
• 5.2.9 水稻FAO 基因的表达模式
• 5.2.10 水稻FAO 基因对逆境的响应
• 5.2.11 水稻FAO 基因的T-DNA 插入突变株系
• 5.3 讨论
• 5.3.1 AtFAO 突变体的表型
• 5.3.2 AtFAO3 和AtFAO4b 的功能差异
• 5.3.3 低温对 LjFAO1 基因表达水平的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章. 全文总结
• 6.1 主要结论
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 附录一 文中部分基因序列
• 附录二 载体图谱
• 在读期间发表论文
• 致谢