DNA生物传感器用于基因点突变识别及新型传感界面的构建

论文摘要

核酸碱基的突变与人类许多遗传疾病有关,它在癌症的发生中也起着不可忽视的作用,基因突变的检测是癌症早期诊断的重要手段。所以探索新的、灵敏度高的检测单核苷酸突变的方法是相关领域专家共同关注的热点问题。本研究论文在电化学DNA传感器用于基因点突变识别以及利用点击化学进行传感界面的构建两个方面做了一些新方法的研究。具体内容分别如下:在第2章中,基于等位基因特异性延伸法,结合酶催化银沉积放大体系,提出了用于单碱基突变的电化学检测方法。首先,在金电极表面固定与野生型目标链完全互补的等位特异性捕获探针,在聚合酶的作用下发生延伸反应;而突变型目标链由于3’端与捕获探针发生错配,延伸反应不能进行。解链处理后,目标链从电极表面脱落。随后滴加与探针延伸部分相互补的生物素化的检测探针,再引入链亲和素化的碱性磷酸酶,继而发生酶催化沉积银的反应。通过线性扫描伏安法定量检测。该方法成功用于β-地中海贫血基因-28位密码子单碱基突变的区分,简单、快速、灵敏度高,线性范围为3.0×10-16-3.0×10-8M,检测下限为1.0×10-16 M。在第3章中,基于连接酶的高保真性和生物催化沉积反应,提出了用于高特异性识别单碱基突变的压电检测方法。实验中,目标DNA链先与通过纳米金修饰在QCM上的DNA捕获探针杂交,再与生物素化的DNA检测探针杂交。加入连接酶后,再经过高温解链,只有与目标链完全匹配的检测探针保留在电极表面。生物素化的检测探针继而与链酶亲和素化的辣根过氧化物（SA-HRP）结合,辣根过氧化物催化过氧化氢氧化4-氯-1-萘酚在电极表面生成不溶性沉淀物,使压电频率响应显著增大。用该方法同样对β-地中海贫血基因-28位密码子的突变情况进行了检测,线性范围为0.1-100 nM,检测下限为0.1 nM。在第4章中,发展了一种基于铜催化点击化学反应构建的新型传感界面用于核酸分子的固定方法,同时以铜离子为分析模型,采用亚甲基蓝为电化学指示剂,进行电化学检测分析。首先在金电极表面固定含有叠氮基团的捕获探针,然后与标记有亚甲基蓝的炔基发夹形检测探针发生点击化学反应,该方法利用一价铜离子的催化效应进行电化学定量检测。此外,在这种稳定性较好的传感界面中,固定于电极表面的核酸分子信标也可作为一种捕获探针与单链DNA分子互补杂交,用于特定基因的分析检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪言
• 1.1 SNP 识别的DNA 生物传感器
• 1.1.1 单核苷酸多态性的概念及检测意义
• 1.1.2 DNA 生物传感器的原理及分类
• 1.1.3 DNA 探针的固定方法
• 1.1.4 SNP 识别的电化学及压电检测方法
• 1.2 “点击化学”反应
• 1.2.1 “点击化学”的基本概念
• 1.2.2 叠氮化物-炔环加成反应
• 1.2.3 点击化学在传感器中的应用
• 1.3 本研究论文的构思
• 第2章 基于等位特异延伸法与生物金属化反应的单碱基突变检测研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 金电极的预处理
• 2.2.3 捕获探针的固定
• 2.2.4 DNA 杂交、表面延伸及解链反应
• 2.2.5 生物金属化反应
• 2.2.6 电化学检测
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 基于等位基因特异性延伸的单碱基突变电化学检测原理
• 2.3.2 探针设计
• 2.3.3 实验条件的优化
• 2.3.4 对野生型和突变型序列的区分
• 2.3.5 对野生型目标链的定量分析
• 2.4 小结
• 第3章 基于酶催化沉积放大检测单碱基突变的DNA 压电传感器研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 传感界面的制备
• 3.2.3 DNA 杂交及连接反应
• 3.2.4 沉积反应与QCM 检测
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 杂交和沉积反应的优化
• 3.3.2 连接反应和解链
• 3.3.3 野生型基因的定量检测
• 3.4 小结
• 第4章 基于点击化学反应的新型传感界面构建及铜离子模型分析
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂和仪器
• 2-修饰的寡核苷酸的标记'>4.2.2 亚甲基蓝标记NH_2-修饰的寡核苷酸的标记
• 4.2.3 N-（3-叠氮丙基）硫庚酰胺的合成
• 4.2.4 传感界面的构建
• 4.2.5 铜催化的点击化学反应
• 4.2.6 电化学检测
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 基于点击化学反应的铜离子检测原理
• 4.3.2 实验条件的优化
• 4.3.3 传感器的分析性能
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢