论文摘要
基因多态性是人类群体中的常见现象,这些差别可能在某些条件下导致人类疾病。快速、准确地对基因多态性进行检测对于疾病预防与控制十分重要。肿瘤等疾病往往伴有多种体细胞突变,成为肿瘤监测、预后等生物标志,或靶向药物的靶点以及反应性标志。不过体细胞突变一般是稀有突变,较难检测,对检测技术要求极高。本论文凭借实时PCR技术平台,利用双链荧光置换探针、ARMS引物、PAP引物、高分辨溶解曲线分析等不同策略,检测不同的突变。论文前三章针对基因多态性检测,第四章针对稀有突变检测。第1章血小板血型抗原的基因分型本章利用荧光双链置换探针,以临床上6个主要的HPA系统的12个抗原为研究对象,建立相应的基因分型方法。首先针对各个HPA系统建立了单重实时PCR,整个检测过程仅需100min,具有特异性好、快速简便的优点。进一步发展的3个四色实时PCR体系只需3个PCR管就能对6个HPA系统的12个等位基因同时进行检测,共用同一个PCR程序,使检测更加简便、高效。第一个四色实时PCR体系能同时对HPA-1和-4进行检测;第二个四色实时PCR体系能同时对HPA-2和-3进行检测;第三个四色实时PCR体系能同时对HPA-5和-15进行检测。用所建立的四色实时PCR技术检测了150份厦门健康献血者样品,结果与对照方法一致,并统计了厦门人群6个基因座位的基因频率,与此前报道的中国人群基因频率相近。第2章ABO血型基因分型本章利用荧光双链置换探针,以ABO血型系统为研究对象,建立相应的基因分型方法。根据ABO基因结构特点,设计7条特异性双链荧光置换探针分别检测O1（261delG）,A（261G）,A（796C/803C）,B（796A/803C）,O2（802G>A）,A2（1059delC）,A2（1009A>G）,并建立单管或双管两种检测模式。单管检测模式可根据四种荧光信号的组合,判断ABO血型的4个表型和6种基因型;双管检测模式可根据7个荧光探针产生的荧光信号变化组合,判断ABO血型的15种基因型。单管检测模式灵敏度可达160 pg的基因组DNA,在0.16-500ng范围有良好的线性关系,对已知表型的110份样品进行了基因定型,并对134份样品进行了盲测。检测结果与PCR-SSP检测结果一致,与已知的血型表型基本一致。双管检测模式对已知表型的110份样品进行了检测,检测结果与PCR-SSP检测结果一致。样品中检测到1份稀有的O1O1V-B样品。单管检测模式盲试中有1份与记录的表型不符,后经测序和PCR-SSP方法证明检测结果正确。第3章HLA-B27实时PCR检测本章利用荧光双链置换探针,以与强直性脊柱炎相关的HLA-B27抗原为研究对象,建立相应的基因检测方法。反复比对了HLA-B基因座位所有等位基因外显子2和3序列,选出B27相对保守又与其他B抗原基因差别较大的区域,设计特异性引物和两条特异性双链荧光置换探针,涵盖了所有已报道的35个亚型（截至2007年2月）。在体系中加入HGH基因检测体系作为内控,预示PCR反应体系和DNA模板提取质量,排除假阴性。对362份中国人的临床样品进行了基因检测并与流式细胞术检测结果进行了比较。362份样品中,359份样品所得结果一致,3份不符,符合率为99%;流式检测164份阳性,198份阴性;实时PCR检测165份阳性,1 97份阴性。第4章非小细胞肺癌吉非替尼药物反应性EGFR稀有突变检测本章利用ARMS引物、双链荧光PAP引物、高分辨熔解曲线分析、以及荧光双链置换探针,以非小细胞肺癌吉非替尼药物反应性有关的29种EGFR突变为研究对象,建立相应的4种检测方法,相互比较每种方法的检测能力,选出检测能力最佳成本最低的检测方法,最后进行临床样品的检测。ARMS引物法对热点突变等大多数突变可以检测到0.1%,其他突变可以检测到1%;双链荧光PAP引物对3个热点突变均可以检测到0.1%,对19-M1可以检测到0.01%;高分辨熔解曲线分析法对4个外显子的29种突变中的23个能够有效检测,检测能力在1-10%之间;荧光双链置换探针法在对19种缺失突变检测中,对19-M1的检测能力可达到1%,对其他缺失突变检测能力在5-10%之间。综合四种方法各自的特点,估算各自的检测成本,考虑到检测方法的难易程度和仪器普及率,结合临床样品实际情况,本研究认为使用ARMS引物法较为合适,即简单廉价又具有较好的检测能力。使用ARMS引物法对12份肺癌临床样品进行了检测,从2份组织样品中检测到热点L858R突变,与测序结果一致;从1份胸水样品中测到缺失突变,但测序检测为野生型。
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