棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

论文摘要

泛素蛋白（Ubiquitin, Ubi）是由76个氨基酸组成的一种高度保守的小分子蛋白质,它以单体或与其他蛋白结合的形式广泛存在于各种真核生物中。泛素主要通过泛素-蛋白水解酶复合体通路（Ubiquitn-proteasome pathway, UPP）途径高效并高度选择性地对细胞内蛋白进行完全或部分降解,尤其是短寿命的功能蛋白、变性变构蛋白、癌基因产物及某些调节因子和信号转导蛋白等。因此,它在DNA的修复、细胞周期运转、信号转导、转录水平上的调节、细胞内吞、抗原呈递、细胞凋亡等过程中具有非常重要的作用。 在一些植物病毒和动物病毒中发现了泛素相关蛋白或泛素化病毒蛋白。已发现宿主的泛素分子共价连接到一些植物病毒上;磷脂类修饰的泛素包装入ASFV、VV、HSV等病毒粒子内;HSV-1的ICPO具泛素连接酶E3的活性,且具有两个E3连接位点,可结合不同的E2;一些逆转录病毒的出芽也与宿主泛素有关。昆虫杆状病毒和痘病毒是目前唯一编码泛素基因的病毒,所有病毒泛素基因编码N-末端泛素序列和1-256个氨基酸的C-末端多肽,在真核细胞泛素中起重要功能的残基在许多病毒泛素中很保守。目前对杆状病毒泛素蛋白的研究还处于初步阶段,其具体功能并不明确。 本文采用PCR方法,根据已知HaSNPV泛素基因设计上游引物和下游引物,克隆了棉铃虫核多角体病毒（HaSNPV）泛素基因。将该基因与pGEM-T载体连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,通过酶切鉴定阳性克隆。经序列分析表明,该泛素基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa。 该基因在原核细胞表达系统中成功地进行了高表达。将泛素基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）上,成功构建了重组质粒pET-Ubi,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白,通过条带扫描分析表达量最高可达总蛋白的20%。用His-tag抗体检测目的蛋白,Westen-blot试验证明所表达的蛋白是带有His-tag的重组融合蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• Ⅰ 前言
• 1.1 杆状病毒简介
• 1.2 泛素及泛素一蛋白酶水解系统的简介
• 1.3 病毒编码的泛素蛋白的研究进展
• 1.4 本研究的目的及意义
• Ⅱ 实验材料
• 2.1 病毒株、菌株及质粒
• 2.2 实验所用试剂
• Ⅲ 实验方法
• 3.1 病毒的扩增，多角体的纯化和 DNA的提取
• 3.2 HaSNPV泛素基因的 PCR扩增与回收
• 3.3 原核表达载体的构建
• 3.4 诱导表达及表达条件的优化
• 3.5 泛素融合蛋白的分离纯化及抗血清的制备
• Ⅳ 结果及分析
• 4.1 泛素基因的克隆与重组质粒的鉴定
• 4.2 泛素融合蛋白的诱导表达与表达条件的优化
• 4.3 表达产物的纯化
• 4.4 泛素融合蛋白及特异性抗体的Western-blot检测
• Ⅴ 讨论
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢