大丽轮枝菌基因敲除体系的建立及分泌蛋白初步分析

论文摘要

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是引起棉花黄萎病的病原菌,在世界范围内造成重大经济损失。已有研究表明大丽轮枝菌的分泌蛋白即毒素蛋白是造成棉花黄萎、落叶和减产的主要因素之一。因此构建大丽轮枝菌基因敲除体系（实验平台）和分泌蛋白预测体系（生物信息平台）,并在此基础上对潜在的毒性分泌蛋白（secreted protein）和分泌系统蛋白（secretion system protein）的编码基因进行功能研究,将为揭示大丽轮枝菌致病机理,寻找防治黄萎病的生物学靶点提供思路。构建了高效的大丽轮枝菌基因敲除体系。具体从以下几方面进行了体系的优化:（1）融合PCR和Gateway技术相结合高效构建基因敲除载体;（2）利用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌;（3）使用在T-DNA之间加入致死基因HSVtk的双元载体,使T-DNA随机插入转化子在添加5-氟脱氧尿苷的培养基上不能存活,从而通过“反向筛选”提高基因敲除的效率。使用上述平台对大丽轮枝菌腺嘌呤合成酶基因和几丁质合成酶基因进行基因敲除验证,基因敲除转化子在总转化子中的比例分别达到87%和44%。建立了预测大丽轮枝菌基因组范围内所有分泌蛋白的计算方法。利用已公布的大丽轮枝菌（V. dahliae VdLs.17）全基因组序列,组合使用生物信息学软件SignalP、TargetP、TMHMM、Big-pi和PROSITE进行计算,预测得到VdLs.17基因组内共有922个分泌蛋白。利用上述分泌蛋白的预测方法,在本实验室两株不同致病性生理型Vd114（弱毒性）和Vd991（强毒性）基因组全测序的基础上,进行比较分析后,得到6个强毒力菌株Vd991特有的分泌蛋白基因,推测它们可能在强致病性型Vd991的致病机制中发挥了重要作用。为验证其生物学功能,通过本文已建立的大丽轮枝菌基因敲除体系,分别得到了上述6个蛋白编码基因在Vd991中缺失的突变体菌株。但是表型分析发现,6个突变体菌株无论从生长速率,产孢量和致病性方面都与野生型菌株Vd991没有明显的变化。其原因可能是由于大丽轮枝菌分泌的诸多毒性蛋白可能共同参与了生物学毒性的产生,缺失一个在功能上冗余的分泌蛋白基因后,不会产生容易识别的表型改变。这一初步结果暗示,较难找到单一的分泌蛋白基因做为防治黄萎病的生物学靶点。LHS（Lumenal Hsp Seventy,内质网Hsp70家族成员）蛋白近年来被发现在稻瘟病菌蛋白分泌中扮演了重要的角色。本研究在Vd991中克隆了其同源基因VdLHS。缺失VdLHS的大丽轮枝菌突变体菌株△Lhs产生的分泌蛋白总量仅有野生型Vd991的24%,并且几乎丧失了对寄主植物军棉1号的侵染能力。因此分泌系统蛋白VdLHS可调控大丽轮枝菌多种蛋白的分泌,在大丽轮枝菌的致病性中起了重要作用。这一初步研究和发现,为防治棉花黄萎病提供了一个潜在的生物学靶点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 大丽轮枝菌分泌蛋白致病性研究进展
• 1.1.1 植物细胞壁降解酶
• 1.1.2 毒素蛋白
• 1.2 研究植物病原性真菌分泌蛋白的方法
• 1.2.1 蛋白质组学研究方法
• 1.2.2 通过功能基因组学研究方法
• 1.3 真菌基因敲除研究进展
• 1.3.1 基因敲除质粒构建方法
• 1.3.2 基因敲除常用的转化体系
• 1.3.3 基因敲除转化子的筛选方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 高效大丽轮枝菌基因敲除质粒的构建方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大丽轮枝菌基因组DNA 的提取
• 2.2.2 靶标基因同源重组片段的构建
• 2.2.3 靶标基因同源重组片段与基因敲除载体pGK02-Gateway 连接
• 2.2.4 重组质粒的转化、筛选
• 2.2.5 重组质粒提取及测序
• 2.3 结果
• 2.3.1 ADE4和ChsV同源重组片段的构建
• 2.3.2 ADE4和ChsV基因敲除质粒的获得
• 2.4 讨论
• 2.4.1 融合PCR 技术
• 2.4.2 Gateway 技术
• 第三章 高效筛选基因敲除突变体方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 试剂和仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 质粒pBHt2-tk（T-DNA 中带有致死基因HSVtk）转化农杆菌
• 3.2.2 致死基因HSVtk 经农杆菌T-DNA 介导插入大丽轮枝菌基因组
• 3.2.3 插入突变体△tk 对F2dU 的敏感性测试
• 3.2.4 基因敲除载体转化大丽轮枝菌
• 3.2.5 基因敲除转化子的筛选
• 3.2.6 候选基因敲除转化子的分子生物学验证--基因组水平
• 3.2.7 候选基因敲除转化子的分子生物学验证--转录水平
• 3.2.8 ADE4 基因敲除突变体的表型分析
• 3.2.9 ChsV 基因敲除突变体的表型验证
• 3.3 结果
• 3.3.1 添加50 μmol/L F2dU 有助于转化子的“反向筛选”
• 3.3.2 ADE4 和ChsV 候选基因敲除转化子的获得
• 3.3.3 分子生物学证据支持ADE4 和ChsV 基因敲除突变体的成功构建
• 3.3.4 生物学表型验证支持ADE4 和ChsV 基因敲除突变体的成功构建
• 3.4 讨论
• 第四章 大丽轮枝菌（V. dahliae VdLs.17）分泌组预测方法的建立及初步分析
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 大丽轮枝菌全基因组分泌蛋白预测及染色体定位分析
• 4.2.2 分泌蛋白的信号肽分析
• 4.2.3 果胶酶与纤维素酶预测
• 4.2.4 病原菌寄主互作蛋白的预测
• 4.2.5 含有RxLx[EDQ]模体蛋白的预测
• 4.2.6 富含半胱氨酸的小分子量分泌蛋白的预测
• 4.2.7 大丽轮枝菌特有分泌蛋白分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 大丽轮枝菌分泌蛋白预测
• 4.3.2 信号肽长度分析
• 4.3.3 信号肽的氨基酸组成分析
• 4.3.4 信号肽C 区特性分析
• 4.3.5 分泌蛋白中的果胶酶与纤维素酶
• 4.3.6 病原菌寄主互作蛋白分析
• 4.3.7 含RxLx[EDQ]模体蛋白分析
• 4.3.8 富含半胱氨酸的小分子量分泌蛋白分析
• 4.3.9 大丽轮枝菌分泌组特有蛋白分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 大丽轮枝菌分泌蛋白预测方法的改进
• 4.4.2 大丽轮枝菌分泌组中潜在的致病性蛋白的挖掘
• 第五章 强毒力菌株（Vd991）相对弱毒力菌株（Vd114）特有分泌蛋白的功能验证
• 5.1 材料
• 5.1.1 基因组数据
• 5.1.2 实验材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 Vd114与Vd991基因组原始Solexa数据的获得
• 5.2.2 基因组数据的组装
• 5.2.3 Vd114与Vd991全基因组基因的详细注释
• 5.2.4 Vd114与Vd991中分泌蛋白预测
• 5.2.5 Vd114与Vd991差异分泌蛋白预测
• 5.2.6 Vd114与Vd991差异分泌蛋白的PCR 验证
• 5.2.7 Vd991特有分泌蛋白的突变体构建
• 5.2.8 突变体的生长速率测定
• 5.2.9 突变体的产孢量测定
• 5.2.10 突变体的致病性实验
• 5.2.11 病情指数的调查和统计
• 5.3 结果
• 5.3.1 基因组原始序列的产生
• 5.3.2 基因组数据的组装
• 5.3.3 基因组的功能注释
• 5.3.4 分泌蛋白预测
• 5.3.5 Vd991相对Vd114特有分泌蛋白的序列分析
• 5.3.6 Vd991特异性分泌蛋白的生物信息学分析
• 5.3.7 突变体的构建
• 5.3.8 突变体的生长速率和产孢量分析
• 5.3.9 突变体致病性分析
• 5.4 讨论
• 第六章 大丽轮枝菌一个分泌系统蛋白VdLHS的功能验证
• 6.1 材料
• 6.1.1 试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 大丽轮枝菌中LHS基因序列的获得
• 6.2.2 大丽轮枝菌中VdLHS系统发育分析
• 6.2.3 LHS 基因缺失的大丽轮枝菌△Lhs的构建
• 6.2.4 突变体△Lhs在不同培养基上的生长速率测定
• 6.2.5 突变体△Lhs产胞外分泌蛋白能力分析
• 6.2.6 突变体△Lhs 的致病性鉴定
• 6.3 结果
• 6.3.1 Vd991中LHS基因的克隆
• 6.3.2 VdLHS 蛋白在不同真菌中的系统发育关系
• 6.3.3 LHS 基因缺失的大丽轮枝菌△Lhs的构建
• 6.3.4 突变体△Lhs产胞外分泌蛋白能力较野生型菌株显著下降
• 6.3.5 突变体△Lhs致病性显著下降
• 6.4 讨论
• 第七章 全文结论
• 7.1 成功构建大丽轮枝菌高效的基因敲除体系
• 7.2 成功构建分泌蛋白预测模型并用于比较基因组学分析
• 7.3 分泌系统（secretion system）蛋白基因VdLHS 可做为防治棉花黄萎病的一个潜在生物学靶点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历