合成的人表皮生长因子及真菌免疫调节蛋白在烟草中的表达与特性分析

论文摘要

本研究将合成的人表皮生长因子基因及从真菌中所克隆的免疫调节蛋白基因分别转入烟草中,并对它们的表达特性进行了分析。 在表皮生长因子的转基因研究中,将该基因的编码序列进行了人为修饰:全部使用了植物偏好的密码子合成全长基因;并在其C端添加内质网滞留肽序列KDEL;将它和标记基因一起置于一个携带MAR序列的植物表达载体中,用于烟草的转化。ELISA检测结果表明:不含MAR序列的转基因烟草中hEGF的表达水平约为总蛋白的0.09%;而含MAR序列的转基因烟草hEGF最高表达水平达到了可溶性蛋白的0.29%。细胞延伸实验证明,重组蛋白使Vero E6细胞得到了最大限度的延伸,与商品化生长因子具有相同的活性。通过MTT实验证明重组蛋白促进了细胞增殖。这些资料表明经过设计的重组hEGF在植物中的积累水平能够大幅度的提高并保持其生物活性。 本研究首次从紫芝（Garnodum japoncium）中克隆出一个新的真菌免疫调节基因,将其命名为FIP-gja,序列递交到NCBI,接收号为:AY987805。大肠杆菌BL21中表达的FIP-GJA达到36.5mg/L培养液。经镍柱纯化的原核表达产物免疫家兔获得高效价多克隆抗体。同时,将FIP-gja与从灵芝（Garnodum lucidum）中克隆出的LZ-8编码基因构建到植物双元表达载体中转入烟草。ELISA检测表明两者在烟草中的表达量分别达到了总蛋白的0.18%和0.31%。功能实验研究结果表明,LZ-8与FIP-gja均能有效的提高TNF-α基因mRNA的转录水平,且提高幅度与剂量有关系。由此体现了植物中表达的真菌免疫调节蛋白具有与天然免疫调节蛋白相当的生物活性。

论文目录

• 前言
• 第一部分 文献综述
• 综述一 表皮生长因子及其植物基因工程研究进展
• 1 EGF的来源
• 2 EGF的结构
• 3 EGF的生物学特性
• 4 EGF的作用机制
• 5 EGF的植物基因工程研究进展
• 5.1 植物基因工程概述
• 5.2 重组 EGF表达研究概况
• 5.3 重组 EGF在植物中的表达研究
• 5.3.1 EGF在蓝藻中的表达
• 5.3.2 EGF在烟草中的表达
• 5.4 EGF植物基因工程研究分析与展望
• 综述二 真菌免疫调节蛋白研究进展
• 1 关于药用真菌（灵芝）
• 2 真菌免疫调节蛋白研究
• 2.1 FIP的来源及特征
• 2.2 FIP的结构
• 2.2.1 初级结构
• 2.2.2 高级结构
• 2.3 FIP与免疫球蛋白重链可变区（Ig VH）的相似性
• 2.4 FIP的功能
• 2.5 FIP的研究意义与前景
• 第二部分 研究内容
• 实验一 合成的人表皮生长因子在烟草中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 基因的人工合成
• 2.2 表达载体的构建
• 2.3 转基因烟草的获得与特性
• 2.4 hEGF在转基因烟草中的表达水平检测
• 2.5 重组hEGF的特性分析
• 3 讨论
• 3.1 转基因植物密码子的优化
• 3.2 引入了内质网滞留肽KDEL
• 3.3 MAR序列在转基因研究中的作用
• 3.4 重组hEGF功能实验
• 4 小结
• 实验二 合成的人表皮生长因子在番茄果实中表达的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 2a11驱动hEGF的表达
• 2.2 转基因番茄的获得
• 2.3 对口服转基因药物研究的看法
• 3 小结
• 实验三 真菌免疫调节蛋白FIP-gja基因的克隆及特性
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 基因的获得
• 2.2 序列分析
• 2.3 二级结构分析
• 2.4 FIP-gja在真菌中的表达分析
• 3 讨论
• 3.1 关于药用真菌
• 3.2 关于真菌免疫调节蛋白
• 4 小结
• 实验四 FIP-gja在大肠杆菌中的表达及其抗体制备
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 载体构建
• 2.2 FIP-gja在大肠杆菌中的表达
• 2.3 抗体制备及效价测定
• 3 讨论
• 3.1 原核表达的意义
• 3.2 ELISA检测过程中的问题
• 3.3 在大肠杆菌的表达
• 3.4 抗体制备的意义
• 4 小结
• 实验五 FIP-gja及LZ-8在烟草中的表达与特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 LZ-8基因的克隆
• 2.2 LZ-8及FIP-gja植物双元表达载体的构建
• 2.3 转基因烟草的获得
• 2.4 转基因烟草中外源蛋白的表达及特性
• 3 讨论
• 3.1 LZ-8基因的克隆
• 3.2 转基因受体的选抒
• 3.3 重组蛋白的特性
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介