论文摘要
牛结核病是一种主要由牛分枝杆菌引起的重要人兽共患病,是全球重要公共卫生问题之一。由于卡介苗（BCG）作为现今唯一获准使用的结核疫苗存在保护作用变动性大等诸多问题,研制新型抗结核疫苗已成为全世界急待解决的重要问题。机体细胞免疫应答在抗牛分枝杆菌感染中发挥着至关重要的作用,因此提高细胞免疫应答水平是研究新型结核疫苗的关键所在。本研究选用能诱导机体产生强烈CD8+T细胞免疫应答的产单核细胞李斯特细菌（Listeria monocytogenes,以下简写为Lm）作为载体,运送存在于致病性分枝杆菌中的富含T细胞表位的重要保护性抗原ESAT-6,并研究表达抗原ESAT-6的重组产单核细胞李斯特菌的免疫特性,评价重组菌作为候选疫苗株的潜力,为新型结核疫苗的研制奠定基础。1、表达牛分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组产单核细胞李斯特菌的构建采用PCR方法从产单核细胞李斯特菌Lm4株基因组中扩增出hly基因的上下游同源片段hlya和hlyb,从质粒pET-3a（+）-esat-6中扩增出目的基因esat-6。再采用Splicing overlap extention PCR方法将扩增的3个片段拼接成hlya-esat-6-hlyb复合片段。利用双酶切反应将hlya-esat-6-hlyb复合片段插入pGEM-T载体。经测序鉴定正确后,再将hlya-esat-6-hlyb复合片段从pGEM-T载体上切下插入穿梭载体pKSV7,构建成重组穿梭质粒pKSV7-hlya-esat-6-hlyb,鉴定正确后分别电转化感受态Lm4和LmΔactA/plcB。经过抗生素和高温双重选择压力实现同源重组,得到2株重组细菌Lm（esat-6）和LmΔactA/plcB（esat-6）。应用2对引物对重组菌进行PCR鉴定,结果表明外源基因esat-6定点整合于载体菌基因组中。体外稳定性检验表明,esat-6基因能在载体细菌基因组中长期稳定存在。这为进一步研究重组菌的免疫特性提供了材料。2、表达牛分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组产单核细胞李斯特菌的免疫特性研究在成功获得2株插入有esat-6基因的重组产单核细胞李斯特菌Lm（esat-6）、LmΔactA/plcB（esat-6）的基础上,对重组菌的免疫特性进行了研究。RT-PCR试验结果表明目的基因esat-6能有效转录。重组菌培养上清溶血试验显示融合蛋白LLO-ESAT-6仍然具有溶血活性,溶血效价达24。LLO作为标签蛋白从蛋白质水平上证实目的抗原ESAT-6的表达。细胞侵袭试验和小鼠半数致死量测定表明重组菌对细胞的侵袭能力明显下降、对小鼠的毒性显著降低,且LmΔactA/plcB（esat-6）的毒力更低。用Lm（esat-6）和LmΔactA/plcB（esat-6）免疫C57BL/6小鼠后,在1×106个脾脏淋巴细胞中分泌特异性INF-γ的细胞个数最高分别达177和178个,而诱导产生IL-4的能力不明显,这表明主要引起小鼠Th1型细胞免疫应答;能刺激小鼠淋巴细胞发生特异性增殖,并能引发一定的迟发性变态反应。以上结果表明重组菌具有良好的生物安全性,能引起一定的特异性细胞免疫应答,具有潜在疫苗开发价值。比较2株重组菌发现它们在一系列免疫特性方面没有明显差别。
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