鞘内注射甘珀酸对腰5脊神经切断大鼠双侧痛觉高敏的影响及机制研究

论文摘要

神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是由于外周或中枢神经系统的直接损伤和功能紊乱引起的疼痛。NP在人群发生率超过1%,常表现为：自发性疼痛（Spontaneous pain）、痛觉高敏（Hyperalgesia）、异常疼痛（Allodynia）和感觉异常（Paresthesia）,严重干扰了患者的生活,是一种常见的慢性疾患。除了损伤侧的疼痛不适,在NP的研究中,经常观察到躯体一侧神经损伤后,身体对侧相应部位也出现自发性疼痛或痛敏,即双侧痛觉高敏现象。双侧痛觉高敏产生的外周和中枢机制一直是近来疼痛研究的热点之一,其发生可能涉及很多通路。近年来,越来越多的研究发现胶质细胞（尤其是星形胶质细胞）主导的神经炎症和神经免疫反应在双侧痛觉高敏的发生和维持中发挥重要作用。星形胶质细胞是中枢神经系统胶质细胞的主要组成部分,在NP的大鼠脊髓中,可见星形胶质细胞的长期（>5个月）活化,鞘内注射星形胶质细胞抑制剂氟代柠檬酸能明显逆转NP,而鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素时对NP的影响不大,因此活化的星形胶质细胞在NP中的重要作用被广泛接受。然而星形胶质细胞参与NP的机制目前仍不清楚,有学者提出星形胶质细胞之间广泛的缝隙连接可能参与了NP时星形胶质细胞的活化,因此进一步深入探讨缝隙连接参与星形胶质细胞的活化机制,有助于进一步阐明NP的发生机制。缝隙连接（gap junction, GJ）是由缝隙连接蛋白（connexin, Cx）组成的跨膜蛋白通道结构,是细胞之间唯一能直接进行物质和信息交换的通道,其主要作用是缓冲离子浓度、形成电突触和参与信号传递。在外周和中枢神经系统,一些神经元和几乎所有的星形胶质细胞都能够表达Cx,小胶质细胞则不表达,神经元之间的GJ相对较少,而胶质细胞（主要是星形胶质细胞）的GJ数量远远大于神经元,而且大多数的星形胶质细胞通过GJ广泛偶联,形成一种星形胶质细胞网络。当星形胶质细胞被伤害性信号激活后,细胞内的Ca2+浓度会迅速升高,可使GJ处的电压门控通道开放,使伤害性信号传导到邻近的星形胶质细胞内,导致邻近的星形胶质细胞也被激活,这种现象被称为钙震荡或钙波。这种钙波可促使星形胶质细胞合成并释放ATP,后者可与神经元细胞膜上的ATP受体结合,进而促使神经元上的离子变化,产生谷氨酸,导致疼痛的维持。因此有学者提出,慢性疼痛时伤害性刺激信号可诱导星形胶质细胞内的钙离子移动,并可通过GJ网络以钙波形式在星形胶质细胞网络中传递,从而引起星形胶质细胞的广泛活化,产生大量的活性因子,最终导致NP时双侧痛觉高敏的产生,但这个观点目前还未得到大量研究的证实。关于活化的星形胶质细胞释放的活性因子,既往研究提示主要包括下列因子如：趋化因子、前列腺素、炎性细胞因子等,其中炎性细胞因子中的肿瘤坏死因子-α（turmor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）,可直接或间接的作用于神经元表面的受体,或作用于其他免疫细胞,调节其它炎性因子的合成和释放,参与NP的发生和维持。Dong-ho Youn等发现鞘内注射TNF-a能诱导大鼠的痛觉高敏,Pinhui Miao等人也观察到PNI模型大鼠术后TNF-α的表达持续高水平,并且主要分布在星形胶质细胞,外周或鞘内注射TNF-α抗体能缓解动物的双侧痛觉高敏,可见TNF-α在双侧痛觉高敏中起了重要的作用。在爪、坐骨神经鞘、脊髓和多个脑区内注射IL-1p后,均能导致动物痛觉高敏的出现,外周或鞘内注射IL-1p抗体能缓解动物的痛觉高敏,这均表明IL-1p参与大鼠痛觉高敏的产生。炎性细胞因子的致痛作用可能与其直接促进痛觉纤维释放降钙素基因相关肽、P物质及兴奋伤害性神经元有关,还可能通过旁分泌和自分泌作用促进一氧化氮、缓激肽、前列腺素及炎性因子释放或敏化痛觉纤维,这些物质还能增加初级传入神经末梢痛递质的释放和增加痛觉传递神经元的兴奋性来扩大痛觉传递,NP有多种动物模型,并且在多个模型中如：坐骨神经炎症模型,慢性坐骨神经束扎模型以及腰5脊神经切断模型等均可出现双侧痛觉高敏。腰5脊神经切断模型是我实验室经常应用的模型,单侧腰5脊神经切断后,损伤侧后肢在术后1天就出现痛觉高敏且持续至少4个月,而在手术后10天对侧后肢即可观察到明显的机械痛敏,对侧后肢痛觉过敏的强度比损伤侧稍低且出现的时间晚,这与临床上一些慢性疼痛病人主诉的对侧疼痛的症状相似。本研究我们采用大鼠腰5脊神经切断（L5spinal nerve transection, SNT）模型,观察鞘内注射甘珀酸（carbenoxolone, CBX）,一个广泛使用的GJ阻断剂,对大鼠双侧机械痛觉高敏的影响,同时观察脊髓背角星形胶质细胞标志物（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和炎性细胞因子TNF-α和IL-1p表达的变化,探讨CBX对大鼠双侧机械痛觉高敏的影响及可能机制。目的：观察鞘内注射不同剂量CBX对SNT大鼠双侧机械痛阈的影响,同时采用免疫组化的方法观察双侧脊髓背角GFAP的表达变化,ELSIA法测定双侧炎性细胞因子TNF-α、IL-1p表达水平的变化。旨在探讨GJ、星形胶质细胞及炎性细胞因子在NP时双侧痛觉高敏发生中的可能作用。方法：60只成年雄性SD大鼠,随机分成五组（n=12）： Ⅰ.假手术组（Sham+NS）,Ⅱ.模型组（SNT+NS）, Ⅲ.SNT+CBX（0.05μg）, Ⅳ.SNT+CBX（0.5μg）, Ⅴ.SNT+CBX（5μg）。Ⅰ组仅暴露腰5脊神经,不切断,Ⅱ至V组根据Kim和Chung创建的方法制作SNT模型,2%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后,常规消毒,俯卧捆绑,腹下垫垫,充分腹曲,沿L4-6脊柱中线切皮,钝性分离脊柱左侧肌肉组织,切横突,暴露腰5脊神经,用3-0的丝线结扎并切断左侧腰5脊神经。在术后10天,Ⅰ组和Ⅱ组鞘内注射生理盐水10μl,Ⅲ至V组鞘内注射CBX0.05gg（10p.1）、0.5μg（10μ1）和5μg（10μl）,分别于术前1d,术后1d、3d、5d、7d、10d及给药后1h、2h、4h、6h每组随机取6只大鼠测双侧机械痛阈（MWT）。鞘内给药2h后每组随机取3只大鼠的腰段脊髓,采用免疫组化技术观察双侧脊髓背角GFAP的表达。另取3只大鼠的腰段脊髓采用ELISA的方法测定双侧脊髓背角TNF-α和IL-1p表达水平。采用SPSS13.0软件进行统计分析,定量资料以例数、均数±标准差（x±s）表示。各独立组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,组间均数两两比较,若方差齐同时采用LSD检验,方差不齐则采用Dunnett’s T3检验。重复测量数据采用多组单因素重复测量数据的方差分析,判断组别和时间点的主效应以及组别和时间点之间的交互效应,若满足球形假设则采用Sphericity Assumed检验,不满足球形假设则采用Greenhouse-Geisser检验,各处理组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,各时间点间比较采用单个重复测量因素的方差分析。P≤≤0.05认为差异有统计学意义。结果：MWT的测定结果1.五组大鼠术前1d双侧MWT均无明显差异（P>0.05）；与术前相比,Ⅰ组术后各时间点双侧MWT无明显差异（P>0.05）；Ⅱ至V组损伤侧术后1d MWT即开始下降（P<0.05）,术后5至10d MWT明显降低（P<0.05）；与术后10d给药前1h相比,Ⅱ和Ⅲ组给药后1、2、4、6h双侧MWT均无明显差异（P>0.05）；Ⅳ组给药后1、2、4、6h损伤侧MWT均无明显差异（P>0.05）,而对侧给药后1h MWT即开始提高（P<0.05）,2h时MWT提高的最明显（P<0.05）,4h时MWT开始下降但仍高于给药前（P<0.05）,6h后MWT与给药前无明显差异（P>0.05）；V组给药后1、2、4h双侧MWT明显提高（P<0.05）,6h后无明显差异（P>0.05）。2.脊髓背角GFAP的测定结果免疫组化的结果显示,Ⅱ和Ⅲ组双侧脊髓背GFAP的染色较Ⅰ组明显增强；Ⅳ组损伤侧脊髓背角GFAP的染色较Ⅰ组损伤侧明显增强,较Ⅱ组损伤侧则无明显变化,而对侧脊髓背角GFAP的染色较Ⅱ组对侧明显减弱；V组双侧脊髓背角GFAP的染色较Ⅱ组明显减弱。GFAP阳性细胞数的比较,Ⅱ和Ⅲ组双侧脊髓背角GFAP的阳性细胞数较Ⅰ组明显增多（P<0.05）；Ⅳ组损伤侧脊髓背角GFAP的阳性细胞数较Ⅰ组损伤侧明显增多（P<0.05）,较Ⅱ组损伤侧则无明显变化（P>0.05）而对侧脊髓背角GFAP的阳性细胞数较Ⅱ组对侧明显减少（P<0.05）；V组双侧脊髓背角GFAP阳性细胞数较Ⅱ组均明显降低（P<0.05）。3.脊髓背角TNF-a和IL-1β的水平ELISA的测定结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ和Ⅲ组双侧脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平均明显提高（P<0.05）；与Ⅱ组相比,Ⅳ组损伤侧脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平无明显变化,而对侧脊髓背角TNF-a和IL-1p的水平明显降低（P<0.05）；与Ⅱ组相比,V组双侧脊髓背角TNF-a和IL-1β的水平明显降低（P<0.05）。结论：1.SNT模型大鼠,损伤侧术后1d机械痛阈开始降低,术后5d至10dMWT明显降低,对侧术后10d MWT明显下降,表现出明显的双侧痛觉高敏。2.鞘内注射CBX可以剂量依赖性的提高大鼠的双侧MWT,同时伴有GFAP和TNF-α、IL-1β水平的降低,提示GJ、星形胶质细胞及炎性细胞因子可能参与双侧痛觉高敏的产生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 主要试剂配制
• 1.5 模型的制备及分组
• 1.6 观察指标
• 1.7 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 MWT测定结果
• 2.2 脊髓背角GFAP的测定结果
• 2.3 脊髓背角TNF-α和IL-1β的水平
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述·镜像痛的研究进展
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 附件