肠球菌、柠檬酸杆菌和芽孢杆菌对鲤鱼前肠粘液的体外粘附研究

论文摘要

为研究细菌对鲤鱼（Cyprinus carpio）肠道的粘附特性、建立有效筛选鲤鱼肠道益生菌的方法,本试验采用体外固定鲤鱼前肠粘液于96孔细胞培养板,并结合同位素示踪的方法,研究了9株细菌的粘附特性和作用机理,以及有益细菌对病原菌粘附的抑制作用。本试验从四川农业大学教学农场水产养殖基地养殖池、动物微生态实验室水族箱和鲤鱼肠道共分离出20株细菌（CM2、WP1、WP2、WP3、GL1、GL2、CI1、WL1、C3、Z2,D1、D2、D3、D4、E1、E2、E3、L1、L2、L3）,以及四川农业大学动物微生态实验室保存的8株芽孢杆菌（JS01、D9401、ND1、ND2、ND3、ND4、ND5和ND6）作为本实验的试验菌株。通过常规的耐热试验和双层平板法拮抗试验,筛选出具有一定耐热性并对致病性大肠杆菌和嗜水气单胞菌具有拮抗作用的5株细菌（Z3、C3、L2、E2、D2）,通过16S rRNA测序,进行菌种的鉴定,最后确定为2株芽孢杆菌（Bacillus）,2株肠球菌（Enterococcus）和1株柠檬酸杆菌（Citrobacter）。本试验中,由于同位素标记物γ-32P-ATP是粘附试验的示踪材料,因此做了γ-32P-ATP对细菌生长影响的试验。实验结果表明:添加同位素标记物的细菌均出现活菌数降低的情况,但是差异不明显,甚至有些细菌出现活菌数增加的现象,说明所有细菌在培养过程中尽管添加了同位素γ-32P-ATP,但是其活菌数均不受影响,能达到试验所需要细菌数量（108～109cfu/ml）。对来源于鱼肠道的肠球菌和柠檬酸杆菌以及养殖环境中的芽孢杆菌的附着活性、细菌表面凝集素和粘液蛋白的受体的化学组成、其对病原菌附着鲤鱼前肠粘液的影响等进行了研究。试验结果表明:鱼源的肠球菌的相对粘附数量极显著高于异源的芽孢杆菌（p＜0.01）,同源的柠檬酸杆菌与异源芽孢杆菌的相对粘附数量差异不显著（p＞0.05）。致病性强的嗜水气单胞菌AH2相对粘附数量极显著高于嗜水气单胞菌AH1、大肠杆菌CVCC2060和大肠杆菌ATCC25922（p＜0.01）。5种菌经高碘酸钠和蛋白水解酶修饰后的附着试验表明,高碘酸钠能极显著降低芽孢杆菌、肠球菌和柠檬酸杆菌的粘附率（p＜0.01）,而蛋白水解酶修饰对多数菌株的影响不显著（p＞0.05）。粘液蛋白经蛋白水解酶处理后,部分菌对其的附着数量显著降低（p＜0.05）,而粘液蛋白经高碘酸钠处理后,5株菌的粘附率显著上升（p＜0.05）。由于细菌表面的凝结素存在差异,导致其相对粘附数量的不同。因此,作为鲤鱼肠道的原籍菌,肠球菌L2的相对粘附数量极显著地高于其他细菌（p＜0.01）。部分细菌通过排斥、竞争、取代的方式能够显著降低部分病原菌的粘附率（p＜0.05）,同时出现显著提高病原菌粘附率的现象（p＜0.05）,这是由于细菌改变了粘液表面结构所致。9株菌均能粘附到粘液体外模型,细菌表面的凝集素主要为具糖蛋白性质的物质,粘液蛋白上存在的5种细菌的特异性受体物质可能为蛋白质。取代作用对于病原菌的粘附抑制效果最好,三种作用方式均具有菌株特异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 立题背景
• 1.2 鲤鱼肠道及其生活环境菌群组成情况
• 1.3 芽孢杆菌和肠球菌的主要作用
• 1.4 致病性大肠杆菌、嗜水气单胞菌对鲤鱼的危害
• 1.5 益生菌的主要作用方式
• 1.5.1 代谢产物抑制病原菌
• 1.5.2 竞争化学物质或能源
• 1.5.3 竞争粘附位点
• 1.5.4 刺激机体免疫应答
• 1.6 益生菌粘附实验研究情况
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要仪器、药品
• 2.2 菌株的分离、纯化
• 2.2.1 分离、纯化
• 2.2.2 细菌活菌数与OD值线性曲线的建立
• 2.3 拮抗实验
• 2.3.1 芽孢杆菌、柠檬酸杆菌和肠球菌的培养
• 2.3.2 病原菌的培养
• 2.3.3 拮抗试验
• 2.4 耐热实验
• 2.5 菌株的鉴定
• 2.5.1 模板的提取
• 2.5.2 PCR
• 2.5.3 电泳
• 2.6 同位素对细菌的生长影响试验
• 2.7 粘附试验
• 2.7.1 菌种以及培养条件
• 2.7.2 同位素标记
• 2.7.3 鲤鱼前肠粘液蛋白的制备
• 2.7.4 粘液中蛋白含量的测定
• 2.7.5 细菌粘附试验
• 2.7.6 细菌经修饰后粘附试验
• 2.7.7 粘液经修饰后粘附试验
• 2.7.8 细菌与病原菌相互作用粘附试验
• 2.7.9 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株的分离结果
• 3.2 体外拮抗结果
• 3.3 耐热试验结果
• 3.4 粘液中蛋白含量
• 3.5 细菌活菌数与OD值线性曲线
• 3.5.1 病原菌活菌数与OD值线性曲线
• 3.5.2 分离菌株活菌数与OD值线性曲线
• 3.6 种属鉴定结果
• 3.7 同位素对细菌生长的影响
• 3.8 菌体对粘液蛋白的直接粘附效果
• 3.9 修饰对益生菌粘附的影响
• 3.9.1 菌体的修饰
• 3.9.2 粘液的修饰
• 3.10 异源和同源菌与病原菌相互作用后的粘附
• 4 讨论
• 4.1 细菌的分离、纯化和命名
• 4.2 细菌的初步筛选与鉴定
• 4.3 鱼类粘膜免疫
• 4.4 动物肠道粘液的性质和功能
• 4.5 同位素标记
• 4.6 粘附试验效果
• 4.7 高碘酸钠和蛋白消化酶的作用
• 4.8 粘附机理
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢