海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的生产、分离纯化、基因克隆及表达的研究

论文摘要

采用单因子试验和表面响应的方法相结合,对产植酸酶培养基组分及条件进行了优化,结果如下:燕麦1.0% （w/v）,葡萄糖2.0% （w/v）,硫酸铵2.3% （w/v）氯化钠2.0% （w/v）,初始pH6.3,培养温度28 oC,培养72 h植酸酶的产量达到最高575.5 U/mL,这同软件预测的569.16 U/mL基本相一致。K. ohmeri BG3胞外植酸酶酶通过分子筛SephadexTM G-75和阴离子交换层析柱DEAE Fast Flow分离纯化,纯化倍数和回收率分别为7.2和10.4%。纯化后植酸酶SDS- PAGE凝胶电泳显示分子量约为98.2 kDa。纯化酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65℃,该酶的温度稳定性较好,在pH3-9范围内稳定性也较好。Mn2+、Ca2+、Mg2+、Li+、K+、Na+、Ba2+和Co2+在浓度5.0mM时对纯化植酸酶有激活作用;而Zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ag+、和Cu2+在浓度5.0 mM时,对纯化的植酸酶有抑止作用。纯化的植酸酶活性被Phenylgloxal hydrate强烈抑制,因此分离纯化的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶。纯化的植酸酶对底物植酸的动力学常数Km值和Vmax分别是1.45 mM和0.083 mM/min。用简并引物法扩增了编码海洋酵母K. ohmeri BG3植酸酶的部分基因,片段长度为1023 bp,NCBI登录号为EU009483。用RACE的方法扩增出了海洋酵母K. ohmeri BG3植酸酶基因5’和3’两端的区域,推导出了该植酸酶基因ORF框,共为1389 bp（NCBI登录号:EU082006）。通过比对海洋酵母K. ohmeri BG3植酸酶的基因序列和cDNA序列,发现两者完全一致,说明该基因没有内含子。K. ohmeri BG3植酸酶基因中含有两个酸性磷酸酶所特有的保守区域RHG X RX P和HD区域,这也说明该植酸酶属于酸性磷酸酶家族的一员。根据基因推导出K. ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列,共462个氨基酸,分子量为51.9 kDa。有一段含有15个氨基酸的信号肽,有6个糖基化位点。分析了K. ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列与其他植酸酶氨基酸序列的同源性,发现其与C. albicans （XP713452）和P. stipitis （XP001385108）植酸酶亲缘关系最近,同源性分别为61%和58%。利用pET表达系统成功实现了植酸酶基因PHY1在大肠杆菌中的表达,重组蛋白部分以活性蛋白形式存在,而大部分以包涵体形式存在。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为51 kDa。重组酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65oC,该酶的热稳定性较好,在pH 3-8范围内稳定性也较好。重组酶在较短时间内可以将植酸水解为不同大小的水解产物,但不能将植酸彻底水解为肌醇。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 植酸及其性质
• 1.1 植酸的发现
• 1.2 植酸的结构
• 1.3 植酸的理化性质
• 1.4 植酸的分布
• 1.5 植酸的抗营养作用及对环境的影响
• 2 植酸酶的来源
• 3 微生物植酸酶的生产
• 3.1 植酸酶的酶活力定义
• 3.2 植酸酶的酶活测定方法
• 3.3 植酸酶的筛选和测定
• 3.4 植酸酶的生产技术
• 3.5 统计学优化方法在微生物发酵中的应用
• 3.6 细菌的植酸酶
• 3.7 酵母的植酸酶
• 3.8 真菌的植酸酶
• 4 植酸酶的的分离纯化
• 5 植酸酶作用的影响因素
• 6 植酸酶的热稳定性
• 7 植酸酶基因工程研究现状
• 7.1 植酸酶基因的克隆与表达
• 7.2 植酸酶的基因表达系统
• 7.2.1 E.coli 表达系统
• 7.2.2 毕赤表达系统
• 8 植酸酶的应用
• 8.1 植酸酶在饲料工业中的应用
• 8.2 植酸酶在食品工业中的应用
• 8.3 植酸酶在医学中的应用
• 9 海洋酵母研究进展
• 10 本论文的研究目的与意义
• 11 本论文研究和讨论的主要内容
• 第二章 海洋酵母KODAMAEA OHMERI BG3 液体发酵生产植酸酶的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 植酸酶活性测定相关试剂的配制
• 2.1.4 K. ohmeri BG3 的培养与植酸酶的制备
• 2.1.5 植酸酶活性测定
• 2.2 方法
• 2.2.1 无机磷标准曲线的测定
• 2.2.2 底物、碳源、氮源的优化
• 2.2.3 筛选显著因子
• 2.2.4 优化显著因子
• 2.2.5 试验模型的验证
• 2.2.6 不同底物含磷量的检测
• 3 结果和讨论
• 3.1 无机磷标准曲线的绘制
• 3.2 不同底物、碳源、氮源对酶活的影响
• 3.3 筛选显著因子
• 3.4 显著因子的优化
• 3.5 验证模型的可行性
• 3.6 不同底物含磷量的测定
• 4 本章小结
• 第三章 海洋酵母KODAMAEA OHMERI BG3液体发酵生产植酸酶及酶的分离纯化和特性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 K. ohmeri BG3 产植酸酶
• 2.3.2 植酸酶酶活测定
• 2.3.3 植酸酶发酵液浓缩
• TM G-75 凝胶过滤'>2.3.4 Sephadex^TM G-75 凝胶过滤
• 2.3.5 DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析
• 2.3.6 层析样品纯度测定
• 2.3.7 纯化植酸酶最适反应温度和温度稳定性
• 2.3.8 植酸酶最适反应pH 和pH 稳定性
• 2.3.9 金属离子对植酸酶活性的影响
• 2.3.10 蛋白抑制剂对植酸酶活性的影响
• 2.3.11 动力学常数Km 和最大反应速度Vmax 的测定
• 3 结果与讨论
• TM G-75 凝胶层析部分纯化'>3.1 植酸酶发酵液浓缩及SEPHRADEX^TM G-75 凝胶层析部分纯化
• 3.2 DEAE-SEPHOROSE FAST FLOW 阴离子交换层析柱纯化
• 3.3 植酸酶纯化过程参数和不连续SDS-PAGE 凝胶电泳
• 3.4 纯化植酸酶最适温度和对温度的稳定性
• 3.5 纯化植酸酶最适PH 和对PH 的稳定性
• 3.6 金属离子对植酸酶酶活的影响
• 3.7 蛋白抑制剂对纯化植酸酶酶活的影响
• 3.8 动力学常数KM 和最大反应速度VMAX
• 4 本章小结
• 第四章 KODAMAEA OHMERI BG3 植酸酶的基因克隆
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 K. ohmeri BG3 基因组DNA 的提取
• 2.3.2 K. ohmeri BG3 总RNA 的提取
• 2.3.3 植酸酶部分基因的克隆
• 2.3.4 RACE
• 2.3.5 从基因组DNA 扩增植酸酶的基因
• 2.3.6 植酸酶酶生物信息学分析
• 3 结果和讨论
• 3.1 植酸酶部分基因的克隆
• 3.1.1 简并引物的设计
• 3.1.2 简并引物PCR 克隆植酸酶基因部分序列
• 3.2 RACE
• 3.2.1 总RNA 的提取
• 3.2.2 3’RACE PCR
• 3.2.3 5’RACE PCR
• 3.2.4 ORF 框的获得
• 3.3 从基因组水平扩增植酸酶基因
• 3.4 K. OHMERI BG3 植酸酶基因PHY1 序列分析
• 3.5 K. OHMERI BG3 植酸酶氨基酸序列（PHY1）分析
• 4 本章小结
• 第五章 K. OHMERI BG3 植酸酶基因PHY1 在大肠杆菌中的表达
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 pET-24a（+）PHY1 表达载体的构建
• 2.3.2 pET-24a（+）PHY1 在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.3.3 重组植酸酶的性质
• 3 结果与讨论
• 3.1 PET-24A（+）PHY1 表达载体的构建
• 3.2 PET-24A（+）PHY1 在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.3 重组植酸酶的性质
• 3.3.1 温度对重组植酸酶活性的影响
• 3.3.2 pH 对重组植酸酶活性的影响
• 3.3.3 重组植酸酶对植酸钠的水解实验
• 4 本章小结
• 参考文献
• 总结与创新点
• 附录
• 博士期间发表的学术论文
• 致谢