血管抑素对肺癌生物学行为的影响及抑制肿瘤血管形成分子机制的研究

论文摘要

前言新生血管形成对于恶性肿瘤的无限制生长和转移有重要意义。恶性实体瘤主要由肿瘤细胞和肿瘤间质两部分组成,而肿瘤的发生、发展和转移与间质中血管的生长密切相关。当肿瘤生长到直径1-2mm（约含106个细胞）时,如果没有血管形成,肿瘤细胞将保持静止状态或发生退化、停止增殖甚至死亡。据此理论Folkman提出“抑制肿瘤血管生成”可作为治疗实体瘤的新途径假说。近20年来,抑制肿瘤血管生成已成为控制肿瘤生长及浸润转移研究的一个重要方面。血管抑素（Angiostatin）是近年来发现的第一个内源性肿瘤血管生成抑制因子,因能直接特异地作用于血管内皮细胞,抑制其增殖、减少肿瘤血管生成而倍受青睐。尽管国内外对血管抑素的研究报道很多,但迄今血管抑素的作用机制尚未完全解明,血管抑素作用于血管内皮细胞的信号途径尚未阐明。已有的研究结果提示,血管抑素抗肿瘤血管形成的机制是多方面的,血管抑素可通过抑制内皮细胞增殖、迁移、诱导其凋亡等途径来达到抗血管生成效应,进而起到抑制肿瘤的生长、浸润和转移的作用。为了确切评价血管抑素的抗新生血管形成作用,阐明血管抑素抗新生血管形成的作用机制,我们在人体材料、动物实验及体外细胞培养三个层面上探讨肿瘤组织中血管抑素的表达与肿瘤血管形成的关系及与血管生成调节因子VEGF之间的联系,明确血管抑素对肿瘤生长的影响,进而探讨血管抑素对内皮细胞增殖、凋亡调节的信号传导途径及其作用的分子机制,为肿瘤的防治提供实验依据。实验材料与方法一、人体材料:采用RT-PCR方法通过检测人肺癌组织中Angiostatin与VEGFmRNA的表达及其与微血管密度的关系,明确其在肺癌的发生、发展过程中的作用及其与临床病理之间的关系。二、动物实验:采用人肺癌A549细胞建立c57BL/6近交系小鼠移植瘤模型进行实验,评价Angiostatin治疗肺癌的有效性。48只荷人肺癌A549C57BL/6近交系小鼠（皮下移植瘤）分成4组,分别皮下肿瘤内注射Angiostatin（浓度分别为0.6mg/Kg、1.2mg/Kg、2.4mg/kg）,对照组注射等量生理盐水。注射次数1次/2d,治疗14天,观察肿瘤重量的变化;并用常规病理方法和免疫组化S-P法检测肿瘤组织中细胞的形态学改变和CD34、Survivin和NF-κB的表达,计数微血管密度（MVD）,观察Angiostatin对人肺癌小鼠移植瘤新生血管形成的影响。三、体外培养:在体外研究中培养HUVECs和人肺癌A549细胞,应用MTT比色法检测血管抑素对HUVECs和A549细胞增殖活性的影响,台盼兰染色细胞计数法观察血管抑素对人肺癌A549和血管内皮细胞生长的影响;建立肿瘤微血管模型观察血管抑素对内皮细胞管腔形成的影响;流式细胞术分析血管抑素对HUVECs细胞生长周期的影响。通过蛋白印记法检测血管抑素对人血管内皮细胞作用的信号传导途径及其相关因子的表达,初步探讨血管抑素抗新生血管形成作用的分子机制。结果一、人体材料检测结果:肺癌组织中Angiostatin mRNA表达量为5.56±1.40,癌旁肺组织mRNA表达量为7.85±1.74;VEGF mRNA表达量癌组织为12.43±1.58,癌旁组织为9.10±1.20。组间比较差异显著（P＜0.05）;Angiostatin mRNA在Ⅰ-Ⅱ期肺癌组织中表达量为9.41±2.29,在Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织中表达量为5.26±2.39,后者表达水平较前者明显降低,差异显著（P＜0.05）;有淋巴结转移组的Angiostatin mRNA表达水平低于无转移组,差异显著（P＜0.05）。VEGF mRNA在Ⅰ-Ⅱ期肺癌组织中表达为9.79±1.45,在Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织中表达为16.83±2.38,后者表达水平明显高于前者,差异极显著（P＜0.01）;在低分化组表达与高-中分化组相比有显著性差异（P＜0.05）;淋巴结转移组表达高于无转移组,差异极其显著（P＜0.01）。Angiostatin与VEGF mRNA在NSCLC中表达的相关性检验结果r=-0.671,P＜0.05,二者呈负相关。二、动物实验显示:（一）肿瘤重量和抑瘤率的检测:随着接种瘤细胞时间的增加,各组小鼠肿瘤都逐渐增大,但Angiostatin治疗组肿瘤生长明显缓慢。与对照组比较,Angiostatin三个剂量组均有抑瘤作用,其抑制程度最高达77%（p＜0.05）;（二）肿瘤微血管密度的检测:对照组移植瘤组织CD34弥漫分布;统计学分析显示Angiostatin治疗组肿瘤的微血管密度下降,随着Angiostatin剂量增加MVD数量减低,治疗组与对照组相比有显著性差异（p＜0.05）。（三）survivin和NF-κBp65的表达:阳性反应产物分布于瘤细胞或内皮细胞的胞浆与胞核内,呈棕黄色。Survivin蛋白在各组的阳性率分别为:对照组100%（12/12）,Angiostatin小剂量组91.6%（11/12）,中剂量组75%（9/12）,大剂量组66.6%（8/12）;NFκBp65在对照组和Angiostatin小剂量组表达的阳性率相同,为33.3%（4/12）,中剂量组16.7%（2/12）,大剂量组25%（3/12）;图象分析结果显示,血管内皮细胞NFκBp65表达对照组为0.313±0.025,对照组Survivin表达则为0.295±0.027,二者随Angiostatin剂量加大其表达逐渐降低;且有统计学意义（P＜0.05）。三、体外细胞实验:（一）MTT检测结果显示:不同浓度的血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24h后,OD490吸光度值均低于对照组,对内皮细胞增殖的抑制作用随着血管抑素浓度的增加而增强,与对照组相比差异均有显著性意义（P＜0.01）。并且随着血管抑素作用时间的延长,细胞增殖明显受抑制,吸光度值均低于对照组。72h时最大抑制率达到91.37%,且与对照组相比差异均有显著性意义（P＜0.01）。（二）流式细胞术检测细胞周期:不同浓度Angiostatin组与对照组比较,G1期细胞比例有所减少,S期有所增加。从4mg/L血管抑素开始出现凋亡,到16mg/L血管抑素时出现了明显的凋亡峰,而且随着剂量增大,凋亡渐强。（三）内皮细胞管腔形成实验:人脐静脉内皮细胞接种于鼠尾胶后,以肿瘤上清液诱导,内皮细胞从散在分布状态逐渐聚集、形成条索状,12h形成明显的网状。在培养人脐静脉内皮细胞3h后（血管网未形成之前）加入血管抑素,未见内皮细胞形成网状结构;内皮细胞培养24h后（血管网已形成）加入血管抑素,8h内皮细胞成网数量减少,变圆,逐渐聚集,12h已形成的血管网状结构破裂,并在断裂后消失。（四）流式细胞术检测内皮细胞整合素αvβ3的表达:对照组平均荧光表达是6.76±2.19,单纯bFGF组42.3±4.41,Angiostatin低剂量组是24.8±4.26,高剂量组为2.34±1.16。两两比较则有明显的统计学意义。表明Angiostatin抑制了bFGF诱导的内皮细胞整合素αvβ3的表达。（五）Western Blot法检测Angiostatin对内皮细胞血管生成相关信号通路的影响:以特异性抑制剂作用后,Akt、P38、FAK的蛋白表达水平较低,bFGF刺激后略有增高。经Angiostatin处理后的内皮细胞中NF-κBp65、Survivin表达水平随Angiostatin剂量增加表达减低。结论1、Angiostatin在人非小细胞性肺癌中的表达与肿瘤的临床分期、分化程度及淋巴结转移有关;NSCLC中Angiostatin与VEGF的表达呈明显的负相关。2、Angiostatin对人A549肺癌小鼠移植瘤生长及新生血管形成具有抑制作用。3、Angiostatin能抑制体外培养人血管内皮细胞的增殖、诱导其凋亡,并抑制肿瘤诱导的体外管腔形成。4、Angiostatin对内皮细胞的抑制增殖或诱导凋亡的作用与整合素avβ3的表达及Survivin、NF-κB有关。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 血管抑素与VEGF在人非小细胞肺癌中的表达及其临床病理意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文二 血管抑素对小鼠肺癌移植瘤生长及血管形成相关因子表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文三 血管抑素对体外培养人血管内皮细胞的作用及分子机制的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介