论文摘要
本实验研究的是Shewanella piezotolerans WP3的异柠檬酸裂解酶,它是乙醛酸循环的关键酶,在WP3基因组里是单拷贝的。WP3分离自西太平洋1914米的深海沉积物中,它是一株革兰氏阴性,兼性厌氧的杆状细菌,耐冷并耐压。其生长温度范围是0-28?C,最适生长温度是20?C,生长压力范围是0-50Mpa。最适生长压力为20Mpa,是研究极端微生物适应极端环境的理想材料[1]。基因芯片的结果表明,当WP3处于一些环境因子,如生长温度、压力的变化,温度,压力的短时间刺激等,很多基因都有明显的改变。本实验从WP3的代谢途径的关键酶出发,探索极端微生物适应胁迫条件时（特别是比较明显的低温和高压条件）异柠檬酸裂解酶的特性和表达特征,进而为研究极端微生物的极端环境适应性机理研究奠定基础。icl的ORF有1581bp,编码526aa,预计分子量大小为58KDa。Icl的序列比对分析表明了WP3icl基因相对于其他中温菌的icl基因和嗜冷菌的Colwellia maris的适冷酶基因icl更为相似。为了深入研究ICL在各种环境下的代谢中所起的作用,我们构建了WP3Icl基因的原核表达质粒,在E. coli中表达后纯化重组ICL,制备抗ICL的多克隆抗体,而且在转录和翻译水平上运用Real-time PCR和Western Blotting研究了icl基因的在各水平上的表达情况。为了研究ICL在乙醛酸循环,甚至WP3整个能量与物质代谢中的地位和角色,我们更进一步构建了WP3的icl的缺失突变体,并研究了icl缺失的情况下WP3的生长状况和它的底物竞争酶—异柠檬酸脱氢酶的表达变化。酶活分析表明,ICL不仅在序列上也是在酶活性质上是一个冷适应酶,它的最适酶活温度是25?C,但它不像C. maris一样是个冷诱导酶。在各个环境变化下的icl基因的转录,翻译水平都有明显的变化,在冷激、热激下,icl基因在转录水平上都出现了明显的低表达,在低温下也有一定程度的下降,但是没有冷激的反应大。而在压力刺激和高压环境下生长时,都出现了高表达。通常低温和高压对深海耐压菌的很多基因具有相似作用方式、原理,特别是与膜流动性,渗透性相关的基因上,而在WP3中ICL对低温和高压的表达出现相反的趋势,这也是一个未来感兴趣的研究方向。ICL对于乙酸的代谢,和其他大多数菌株一样,是必需的,在转录、翻译水平都有高表达。而在WP3的icl突变体中,在20?C和4?C的菌株生长状况和野生菌相比,没有什么变化,我们推测在WP3中,乙醛酸循环只是起辅助的作用,即使菌株在相对恶劣的环境中,而TCA循环一直都是主要的代谢循环。而icl的缺失并没有导致异柠檬酸脱氢酶的表达上调,而是出现了表达下调,说明ICL和IDH的关系更多的是代谢过程中中间产物上的互助,支援互补关系,而不是底物的竞争关系。