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赤霉菌侵染后小麦穗部表达蛋白的差示分析及钙网联蛋白基因的克隆研究

2020-11-23阅读(99)

赤霉菌侵染后小麦穗部表达蛋白的差示分析及钙网联蛋白基因的克隆研究

论文摘要

小麦赤霉病是一种全球性的小麦病害，严重地影响着小麦的产量和品质。赤霉病抗性机理不清楚、遗传机制复杂，这在很大程度上影响了对小麦赤霉病的控制。因此，小麦赤霉病抗性机理的研究，无论是对基础研究还是对应用研究中都具有重要意义。蛋白质组学分析是功能基因组学研究中一种重要的手段，已在遗传学、生理学、病理学等多个领域得到了广泛的应用。本研究以抗赤霉病小麦品种望水白为材料，构建了F. graminearum侵染前和侵染后6、12、24小时小麦穗部蛋白的表达谱。通过比较侵染前后蛋白表达水平的变化，得到了117个在侵染后与侵染前呈现出2倍表达水平差异的蛋白质点，并对其中的30个蛋白质点进行了质谱分析鉴定。其中，烯醇化酶、脂酰CoA还原酶等一系列与代谢相关的蛋白质表现出下调表达趋势；而一些与胁迫应答相关的蛋白，如热激蛋白、钙网联蛋白、LRR类似蛋白则表现出上调表达的趋势。利用中国春缺体-四体材料对这30个差异表达蛋白的基因进行了染色体定位研究，将编码受铁抑制ABC转录因子、木葡聚糖-1，4-D-葡萄糖苷酶、磷酸核酮糖激酶、蔗糖-果聚糖6-果糖基转移酶、Mla类似蛋白、dnaK热激因子70、钙网联蛋白、jacalin类似蛋白LEM2、β-葡萄糖苷酶、CONSTANS类似蛋白的基因分别定在了小麦2B／3B、6B、2D、4B、1A、5A、5A、2D、7D和3A染色体上。用RT-PCR的方法，从F. graminearum侵染后6小时的小麦穗部分离了钙网联蛋白基因的全长cDNA克隆，并将其命名为TaCRT（Accession no. AAW02798）。该基因编码一包含415个氨基酸残基的多肽，与大麦钙网联蛋白基因的相似性达96％。序列比对分析发现植物钙网联蛋白间的相似性很高，除了N-domain、P-domain和C-domain三个保守的功能结构域外，还存在着糖基化、豆蔻酰化和核定位等保守的基序，在进化上则分成单子叶和双子叶两族。染色体定位结果表明，TaCRT位于小麦染色体5A长臂上；表达分析结果表明：TaCRT在不同组织、不同发育阶段表现为组成型表达，而在BA、高温、F. graminearum及PA诱导的细胞程序性死亡过程中表现出上调表达的趋势。为进一步验证钙网联蛋白Ca2+结合特性，构建了pET32a-TaCRT-E.coli BL21的原核表达系统，分离纯化表达的钙网联蛋白，用偶氮胂Ⅲ法测定得到钙网联蛋白的平均Ca2+结合容量为33.3。为进一步研究TaCRT基因在植物抗病反应过程中可能的生物学功能，我们利用农杆菌介导的叶盘转化法，得到了TaCRT过量表达的转基因烟草植株，PCR和GUS活性检测结果表明TaCRT已经成功地转入烟草植株。烟草花叶病的侵染实验结果表明：转基因烟草植株对烟草花叶病毒的抗性明显提高。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 文献综述
  • 一、蛋白质组学研究技术
  • （一） 样品制备
  • 1、分步提取
  • 2、特殊植物材料蛋白质样品制备
  • 3、膜结合和疏水蛋白的提取
  • 4、细胞器蛋白的提取
  • 5、连续分步溶解
  • （二） 蛋白质分离技术
  • 1、双向电泳
  • 2、多维液相色谱
  • 3、金属亲和迁移凝胶电泳
  • 4、亲和色谱
  • 5、固定化金属离子亲和色谱
  • （三） 蛋白质分析鉴定技术
  • 1、质谱技术
  • 2、蛋白质的N-端和C-端氨基酸序列分析
  • （四） 蛋白质组学中的生物信息学
  • （五） 蛋白质相互作用研究技术
  • 二、蛋白质组学研究进展
  • （一） 蛋白质组学在遗传研究中的应用
  • 1、多样性分析
  • 2、突变体分析
  • （二） 蛋白质组学在发育生物学研究中的应用
  • 1、不同组织/器官蛋白质组学研究
  • 2、细胞器质蛋白质组学研究
  • （三） 植物非生物胁迫的蛋白质组学研究
  • 1、冷害
  • 2、干旱
  • 3、高温
  • 4、氧胁迫
  • 5、盐胁迫
  • 6、机械损伤
  • 7、缺/低氧胁迫
  • 8、臭氧胁迫
  • 9、重金属离子胁迫
  • （四） 植物生长调控的蛋白质组学研究
  • （五） 植物与其它生物相互作用的蛋白质组学研究
  • 1、真菌-植物相互作用
  • 2、寄生虫-植物相互作用
  • 3、病毒-植物相互作用
  • 4、根瘤菌-植物相互作用
  • （六） 蛋白质组学在医学研究中的应用
  • （七） 蛋白质组学在药物开发研究中的应用
  • 三、蛋白质组学研究的发展趋势和重要意义
  • 第二章 F.graminearum侵染后穗部表达蛋白的差异分析
  • 引言
  • 材料与方法
  • 一、实验材料
  • 二、仪器和试剂
  • 三、接种和取样
  • 四、蛋白质样品制备
  • 五、蛋白质浓度测定
  • 六、等电聚焦
  • 七、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 八、银染
  • 九、图像扫描与分析
  • 十、胶内酶解
  • 十一、肽混合物的MALDI-TOFMS分析
  • 十二、数据库检索
  • 十三、染色体定位
  • 结果与分析
  • 一、F.graminearum侵染后不同时段小麦穗部蛋白的2-DE分析
  • 二、差异蛋白质点的定量分析
  • 三、差异蛋白质点的质谱分析与鉴定
  • 四、差异表达蛋白基因的染色体定位
  • 讨论
  • 第三章 小麦钙网联蛋白基因的克隆与功能分析
  • 引言
  • 材料与方法
  • 一、实验材料
  • 二、基因组DNA及总RNA的提取
  • 三、RT-PCR和半定量RT-PCR
  • 四、小麦钙网联蛋白的生物信息学分析
  • 五、PA诱导的细胞程序性死亡及Trypan染色
  • 六、PCR及PCR产物的克隆
  • 七、TaCRT在大肠杆菌中的表达、纯化、酶切及SDS-PAGE
  • 2+浓度测定及钙网联蛋白Ca2+结合容量的测定'>八、Ca2+浓度测定及钙网联蛋白Ca2+结合容量的测定
  • 九、过量表达载体的构建和转化
  • 十、农杆菌介导法烟草的遗传转化
  • 十一、转基因烟草的PCR及GUS检测验证
  • 结果与分析
  • 一、小麦钙网联蛋白基因全长cDNA的克隆
  • 二、钙网联蛋白在不同物种中的保守性分析
  • 三、TaCRT的表达分析
  • 四、TaCRT在细胞程序性死亡过程中的表达分析
  • 五、TaCRT上游序列的分离
  • 2+结合能力'>六、TaCRT的纯化及其Ca2+结合能力
  • 七、TaCRT的过量表达提高了烟草对花叶病毒抗性
  • 讨论
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 全文创新点
  • 发表文章情况
  • 致谢

    • 相关论文文献

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