绵羊性别鉴定PCR方法的研究

论文摘要

本文通过对绵羊性别决定基因检测多重和巢式PCR体系的建立及优化、性染色体引物的特异性检测，建立了绵羊性别决定基因检测的PCR方法，并讨论了影响PCR扩增的几个因素以及它们之间的相互关系。主要内容包括：（1）从GenBank中检索到长度为723bp的绵羊SRY基因序列作为Y染色体特异序列，长度为3249bp的β-B-珠蛋白基因作为常染色体内标基因序列，利用Primer 3软件，设计了长度均为20bp性染色体巢式引物SRY337、SRY193和常染色体的巢式引物G559、G278。（2）对所设计的引物进行筛选组合，建立了绵羊早期胚胎性别鉴定的多重和多重巢式PCR反应体系。（3）对多重PCR体系用4×3×4因子组合析因设计实验（dNTP的终浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM；Mg2+浓度分别为1.5mM、2mM、2.5mM、3mM：温度分别为58℃、60℃、62℃）确定了dNTP浓度、Mg2+浓度和温度的最优组合，优化了扩增程序。对巢式PCR体系第二轮扩增进行了不同dNTP浓度、Mg2+浓度和温度、以及不同扩增程序的筛选和优化。（4）用本试验中所采用的SRY巢式引物分别对人、牛、兔基因组DNA及淋巴细胞缓冲液进行扩增，检测引物的特异性和分析性别鉴定过程中可能存在的污染因素。绵羊肝组织基因组扩增结果表明：公羊可同时扩增出性染色体和常染色体片段，而母羊只能扩增出常染色体片段，引物特异性高，外引物间、内引物间扩增温度相差不大，可进行多重扩增。通过析因试验筛选的最优多重PCR性别鉴定体系为：SRY337、G559的浓度分别为0.4州，Mg2+为2.0 mM，dNTP为300μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—58℃退火30s—72℃延伸20s}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。优化后的多重PCR体系扩增公羊肝组织基因组，灵敏度为100pg。在巢式PCR中，以建立的最优多重PCR体系进行第一轮扩增20个循环后，析出5μl进行第二轮扩增，其最优反应体系为：SRY193、G278浓度均为0.4μM，Mg2+为2.0 mM，dNTP为200μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—64℃退火延伸20s—}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。本多重巢式PCR性别鉴定体系的灵敏度为100fg（1个细胞约5pg），4细胞的DNA就可扩增鉴定结果，总鉴定时间约为110min。特异性检测结果表明：SRY基因引物只对羊、牛雄性特异，其他动物雄性DNA及淋巴细胞缓冲液均不影响检测结果。本实验所建立的巢式PCR体系相对简单、快速、准确率高，完全可以在生产实践中用来鉴定绵羊性别。

论文目录

• 中文摘要
• SUMMARY
• 第一章 文献综述
• 1 哺乳动物性别决定的机理
• 1.1 性别决定相关基因及其研究进展
• 1.1.1 SRY基因
• 1.1.2 与性别决定相关的其他基因
• 1.2 性别决定的分子模型
• 1.2.1 Z-基因模型
• 1.2.2 DSS-基因模型
• 1.2.3 Jimenez模型
• 1.2.4 Jennifer的模型
• 2 动物性别控制技术与其研究进展
• 2.1 受精前性别控制技术
• 2.2 受精后性别控制技术
• 2.2.1 细胞遗传学方法-核型分析法
• 2.2.2 免疫学方法
• 2.2.3 X染色体相关酶法（X-Linked Enzymes）
• 2.2.4 分子生物学方法
• 3 PCR法进行牛羊性别控制现状及其发展前景
• 第二章 绵羊性别鉴定多重PCR体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 组织样品
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要仪器
• 1.2.2 主要药品
• 1.2.3 溶液配制
• 2 试验方法
• 2.1 羊总基因组DNA的制备
• 2.2 基因组DNA的检测
• 2.3 模板DNA的稀释
• 2.4 细胞计数
• 2.4.1 白细胞的制备
• 2.4.2 白细胞的计数
• 2.4.3 白细胞的稀释
• 2.4.4 白细胞DNA的提取
• 2.5 引物设计
• 2.5.1 引物的合成与稀释
• 2.6 PCR反应体系和反应程序
• 2.7 引物的筛选与组合
• 2.8 PCR扩增产物检测
• 2.9 PCR体系的优化
• 2.9.1 引物浓度的选择
• 2.9.2 用析因设计进行PCR体系的优化
• 2.9.3 酶浓度的影响
• 2.9.4 灵敏度的检测
• 2.9.5 不同反应体系的影响
• 2.9.6 循环次数的影响
• 2.9.7 扩增程序的选择
• 3 最优PCR体系的应用
• 3.1 公母羊基因组的扩增
• 3.2 淋巴细胞的扩增
• 4 结果与分析
• 4.1 羊肝组织基因组DNA的检测
• 4.2 引物的筛选
• 4.3 多重PCR体系优化的结果
• 4.4 优化后的多重PCR体系
• 5 讨论
• 5.1 多重PCR的灵敏度
• 5.2 多重PCR引物浓度
• 2+、dNTP及退火温度'>5.3 MG²⁺、dNTP及退火温度
• 6 结论
• 第三章 绵羊性别鉴定巢式PCR的建立及优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 基因组DNA的提取与检测
• 2.2 细胞计数及其DNA的提取
• 2.3 引物设计与稀释
• 3 羊早期胚胎性别鉴定巢式PCR体系的建立
• 3.1 绵羊早期胚胎性别鉴定巢式PCR体系的优化
• 3.1.1 巢式PCR体系扩增温度的确定
• 2+浓度对扩增结果的影响'>3.1.2 Mg²⁺浓度对扩增结果的影响
• 3.1.3 dNTP浓度的选择
• 3.1.4 灵敏度的检测
• 3.1.5 扩增程序的选择
• 3.2 优化后巢式PCR体系的应用
• 3.2.1 巢式PCR扩增公母羊基因组
• 3.2.2 巢式PCR扩增淋巴细胞
• 4 结果与分析
• 4.1 温度选择
• 4.2 镁离子对扩增结果的影响
• 4.3 不同DNTP浓度对扩增结果的影响
• 4.4 巢式PCR扩增的灵敏度
• 4.5 两步与三步控温法扩增结果
• 4.6 扩增公母羊基因组
• 4.7 单细胞扩增
• 5 讨论
• 2+对扩增结果的影响'>5.1 MG²⁺对扩增结果的影响
• 5.2 两步控温巢式PCR扩增法对扩增结果的影响
• 5.3 巢式PCR灵敏度
• 6 结论
• 第四章 特异性检验
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 溶液的配制
• 1.2.2 人头发DNA的提取
• 1.2.3 家兔、牛、羊的基因组提取
• 1.2.4 对家兔、男人、牛、羊基因组等进行巢式PCR扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介