纳米羟基磷灰石的制备及其用于细胞中过氧化氢的测定

论文摘要

细胞在代谢过程中不断产生各种活性氧（reactive oxygen species, ROS）,如超氧阴离子自由基（O2-）、羟基自由基（·OH）、脂自由基（ROO-）、过氧化氢（H202）等,其中H202是最为稳定的一种ROS。研究发现过氧化氢在细胞代谢过程中扮演着重要的调节作用,它可与细胞内的生物大分子反应,引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶变性、DNA损伤等,最终导致细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病的发生。因此建立一种简单快速的方法用于H202浓度的检测,对临床疾病的预防、诊断和监控具有重要意义。本论文研究了纳采羟基磷灰石、辣根过氧化物酶-纳米羟基磷灰石（HRP-HAP）复合物的制备并将其用于细胞中H202的测定。主要内容如下：1.纳米羟基磷灰石（HAP）的制备及表征。以Ca（OH）2和H3PO4原料,用共沉淀方法制备了纳米羟基磷灰石；采用X射线衍射（XRD）、透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、红外光谱（FTIR）等方法对其进行了表征。XRD结果表明制备的HAP为六方晶型；TEM表明制备的HAP为针状结构,长约为160-180 nm,宽约为20-25 nm,并且晶粒分散较好,没有严重的团聚现象；SEM表明HAP具有良好的三维孔状结构。2.辣根过氧化物酶（HRP）在纳米羟基磷灰石（HAP）表面的固定、直接电化学及对H202还原的电催化作用。将HRP分子修饰到HAP表面制备了HRP-HAP复合物,采用红外光谱（FTIR）,紫外光谱（UV-vis）及电化学方法（CV）对其进行了表征,结果表明HRP成功地吸附在HAP表面。将HRP-HAP修饰到GC电极表面制备了HRP-HAP/GC电极,用伏安法研究了HRP-HAP/GC电极的电化学性质。结果显示,HRP固定在HAP表面后能够进行有效的直接电子转移,其循环伏安曲线上不仅表现出一对良好的、几乎对称的氧化还原峰,氧化、还原峰电位分别为-338 mV和-401mV（vs.SCE）,式量电位E0’为-370 mV,且几乎不随扫速的变化而变化,表观电子传递速率常数ks为3.77±0.78 s-,说明HAP纳米材料能够提供一个很好的微环境以加速HRP的电子转移。用伏安法和计时电流法研究了HRP-HAP/GC电极对H202还原的电催化作用。结果表明,在电位为-400 mV时,HRP-HAP/GC电极对H202具有最佳的响应,响应时间约为2s,催化电流与H2O2浓度在5μmol/L～0.82 mmol/L的范围内呈线性相关（相关系数为0.998）,最低检测限达到了0.1μmol/L。此外,该电极还可用于实际样品中过氧化氢的检测。3.辣根过氧化物酶-纳米羟基磷灰石（HRP-HAP）修饰电极用于RAW264.7小鼠巨噬细胞中H202的检测。用伏安法研究了HRP-HAP/GC电极对RAW264.7细胞中H202的测定,根据响应电流与浓度的关系曲线得出细胞内H202浓度约为8 nmol/L。同时,用该电极研究了N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽（fMLP）对RAW264.7细胞H202释放的刺激作用,结果表明,在加入fMLP （0.3μmol/L）后,随着时间的延长,细胞中H202释放量逐渐增大,在30 min时达到了最大值（约为17nmol/L）,之后浓度逐渐降低。表明该方法可用于细胞内H202释放的动力学过程研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 过氧化氢的分析方法现状
• 1.1.1 滴定法
• 1.1.2 化学发光法
• 1.1.3 荧光法
• 1.1.4 紫外-可见分光光度法
• 1.1.5 高效液相色谱法
• 1.1.6 电化学方法
• 1.2 生物传感器概述
• 1.2.1 生物传感器的基本原理
• 1.2.2 生物传感器的分类
• 1.2.3 生物传感器的发展阶段
• 1.2.4 生物传感器构建中生物活性成分的固定
• 1.3 纳米材料在电化学生物传感器中的应用
• 1.3.1 贵金属纳米粒子
• 1.3.2 氧化物纳米粒子
• 1.3.3 半导体纳米粒子
• 1.3.4 碳纳米管
• 1.3.5 无机盐纳米粒子
• 1.4 纳米羟基磷灰石概述
• 1.4.1 羟基磷灰石的结构
• 1.4.2 羟基磷灰石的制备方法
• 1.4.3 羟基磷灰石的用途
• 1.5 本论文的指导思想
• 第2章 纳米羟基磷灰石的制备、表征及其表面辣根过氧化物酶的直接电化学研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 纳米HAP的合成,HRP的固定及HRP-HAP/GC电极的制备
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 表征
• 2.3.2 HRP-HAP/GC电极的电化学性质
• 2.4 结论
• 2O₂的测定'>第3章 HRP-HAP/GC的电催化活性及其对RAW264.7小鼠巨噬细胞内H₂O₂的测定
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 细胞的培养和溶菌液的准备
• 3.2.4 细胞增殖实验
• 3.3 结果与讨论
• 2O₂在HRP-HAP/GC电极的电催化还原 #32’'>3.3.1 H₂O₂在HRP-HAP/GC电极的电催化还原 #32’
• 3.3.2 HRP-HAP/GC电极的计时电流响应
• 2O₂的检测'>3.3.3 细胞中H₂O₂的检测
• 3.4 结论
• 第4章 结论与创新
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢