生长抑素在斑马鱼胚胎发育中的时空表达及功能研究

论文摘要

生长抑素（SS,somatostatin）是广泛存在于脊椎动物中的一种小分子多肽,在体内具有众多功能。在脊椎物动体内以PPSS形式存在,经组织特异性酶切加工后生成成熟的多肽,通常以14肽或者氨基端延长的形式（如：SS14、SS28、SS26等）存在。脊椎动物中SS广泛存在于神经系统及外周组织中,例如中枢及外周神经系统神经元、胃肠道、胰脏、甲状腺等组织。SS的功能也多种多样.例如SS可影响机体的生长,能量分配,消化和代谢等多个方面。SS也可能影响发育过程研究发现SS在小鼠胚胎中瞬时表达,在神经系统发育中能影响神经元的迁移。对SS在发育中的功能了解并不多。而且脊椎动物中研究发现SS基因具有多样性,很可能预示了其功能的复杂性及多样性。本研究以斑马鱼为模型,利用RT-PCR、原位杂交（1SH）对SS在胚胎早期发育过程中的时空表达特点进行了研究,并利用显微注射、MOs敲降、营救等方法对SS1在胚胎发育中的功能进行了初步的研究。利用RT-PCR克隆得到四种SS基因（SS2、3、5、6）的cDNA全长及序列。根据软件推导的氨基酸序列表明SS多肽C-末端14个氦基酸较为保守,包括2个Cys。两个Cys之间形成二硫键对于SS形成特定的构象非常重要,C-末端14个多肽相对保守,是SS及SS-样多肽的特征性序列。斑马鱼胚胎中不同SS基因具有不同的时空表达模式。SS2瞬时表达于内耳原基中,而且在间脑中众多神经元中表达,如NPO （neurosecretory preoptic nucleus）区、后结节区（PT,posterior tuberculum）等部分神经元中,提示SS2可能在神经内分泌中发挥调控作用。SS3在斑马鱼胚胎头部底部细胞中瞬时表达,而在胰脏中持续表达,可能预示SS3表达细胞是内分泌胰脏的重要组成部分。此外3dpf间脑部分神经元中也表达SS3,提示SS3也可能参与了神经内分泌调控。SS5在胚胎期斑马鱼中表达于间脑神经元中,预示其很可能也参与了神经内分泌调控。而SS6在斑马鱼胚胎中未检测到明显的表达信号,该结果似乎不是因为RNA探针降解所致,而RT-PCR检测结果提示SS6在斑马鱼胚胎表达,因此需要进一步研究以揭示SS6在斑马鱼胚胎中的时空表达特点。本实验利用人工合成的针对SS1起始密码子附近区域的morpholino,显微注射斑马鱼胚胎的方法敲降SS1基因的表达,结果发现SS1基因敲降显著降低了斑马鱼的运动能力,而且使斑马鱼的个体发育受到阻滞。和野生型对照组胚胎相比SSI morphant主要形态学特征为：体长较短、眼较小、卵黄吸收障碍、卵黄延伸缺陷等。本实验成功构建了一系列表达质粒：（1）表达EGFP的真核表达质粒pCS2+EGFP:（2）SS1 MOs功效验证载体pCS2+SS1 MO chk EGFP:（3）MOs识别区突变了的SS1-EGFP融台表达质粒pCS2+SS1 EGFP;（4）MOs结合区突变了的SS1表达质粒pCS2+SS1。将上述质粒单独或与SS1 MOs共注射斑马鱼胚胎,结果表明：（1）pCS2+EGFP载体可在斑马鱼胚胎中表达GFP；（2）SS1 MOs和pCS2+SS1 MO chk EGFP共注射胚胎中不表达GFP,表明SS1 MOs能有效敲降SS]基因的表达,具有较高的特异性；（3）注射pCS2+SS1 EGFP的胚胎可表达GFP;（4）共注射SS1 MOs和SS1 mRNA的斑马鱼胚胎表型和对照组胚胎没有显著等异,因此体外合成的SS1 mRNA可以营救morphant表型缺陷。

论文目录

• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 SS信号系统
• 1.2 SS的功能
• 第二章 绪论
• 2.1 选题背景与意义
• 2.2 研究内容与技术路线
• 第三章 斑马鱼SS基因的克隆及时空表达
• 3.1 材料和试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 分析与讨论
• 第四章 SS1在斑马鱼胚胎发育中的功能研究
• 4.1 材料和试剂
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文及参与科研项目