单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制

论文摘要

建立检测单增李斯特菌(LM)的快速检测方法,对人类健康及畜牧业生产具有重要的意义和应用前景。本研究选取致病性李斯特菌特异性蛋白—肌动蛋白聚合蛋白(ActA)为对象,利用原核表达系统表达ActA融合蛋白,以亲合层析纯化表达产物,获得了较高纯度的表达蛋白ActA。以纯化的ActA蛋白免疫小鼠进行免疫原性研究,结果表明ActA可激发机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫,为以ActA蛋白为靶抗原,建立LM免疫学检测方法的研究及LM疫苗的研制奠定了基础。以LM为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,以纯化的ActA蛋白作为ELISA检测的包被抗原,制备LM特异性单克隆抗体并进行特性分析,辛酸—硫酸铵法结合G—蛋白亲合层析法纯化单抗腹水,选取两株纯化的单抗分别用于免疫胶体金的标记和胶体金试纸检测线的包被,研制检测LM的胶体金试纸,研究结果表明该试纸具有较高的敏感性和特异性,可以从模拟样本中有效地检出LM。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 单增李斯特菌的研究进展
• 1 LM 的生物学特性
• 2 LM 的分型
• 3 致病机理与毒力因子
• 4 抗LM 感染的免疫机理
• 5 LM 的流行情况与检测技术研究进展
• 第二章 免疫胶体金检测技术研究进展
• 1 免疫胶体金技术简介
• 2 免疫胶体金的制备
• 3 免疫胶体金检测技术及其应用
• 4 免疫胶体金在其它领域的应用
• 5 展望
• 第二篇 研究内容
• 第一章 单增李斯特菌ActA 的原核表达与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 LM 基因组DNA 的提取
• 2.2 目的基因PCR 扩增
• 2.3 重组质粒pMD-18T/ActA 的鉴定
• 2.4 actA 基因的序列测定
• 2.7 多克隆抗体效价测定
• 2.8 蛋白质印迹分析
• 2.9 纯化蛋白ActA 的SDS-PAGE 分析
• 2.10 纯化蛋白ActA 的浓度测定
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 单增李斯特菌ActA 的免疫原性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 小鼠血清抗体的检测
• 2.2 淋巴细胞转化试验
• 2.3 T 淋巴细胞亚群分类试验
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 单增李斯特菌单克隆抗体的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 免疫小鼠血清抗体效价
• 2.2 细胞融合、筛选和克隆
• 2.3 杂交瘤细胞染色体众数
• 2.4 单抗亚型的鉴定
• 2.5 单抗的纯度分析及分子量测定
• 2.6 单抗效价的测定
• 2.7 腹水中蛋白浓度及抗体含量测定
• 2.8 单抗亲和力测定
• 2.9 单抗特异性检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 单增李斯特菌胶体金试纸的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 胶体金的鉴定
• 2.2 亲合纯化羊抗小鼠 IgG 抗体的浓度测定与纯度分析
• 2.3 抗体与胶体金结合的最适pH 值确定
• 2.4 抗体与胶体金结合的最佳浓度的确定
• 2.5 制备胶体金探针的鉴定
• 2.6 胶体金探针稳定性试验
• 2.7 试纸的制备
• 2.8 特异性试验
• 2.9 敏感性试验
• 2.10 稳定性试验
• 2.11 模拟样品试验
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的主要论文
• 摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介