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银耳二型态细胞差异的研究

2020-11-29阅读(801)

银耳二型态细胞差异的研究

论文摘要

真菌二型态是指某些真菌在环境因素的影响下而具有在酵母型和菌丝型两种形态间发生互变的能力。二型态致病真菌因其形态转换的过程常与致病性有密切关系而引起了人们的广泛关注。真菌二型态转换过程与其培养环境中的物理、化学和营养等环境因子有关,内部则主要与cAMP-PKA途径、MAPK途径和Rim101途径等信号转导途径有关。本实验以银耳的担孢子、节孢子和菌丝体为材料,研究环境因子对银耳二型态转换的影响,并通过显微观察、总蛋白和同工酶电泳分析、随机引物RNA指纹技术（RAP-PCR）揭示银耳二型态细胞间的差异性。显微观察表明:银耳的担孢子和节孢子在培养的过程中能反复芽殖,产生大量酵母状细胞,可亲合的酵母状细胞配对后能长出萌发管,融合并形成具有锁状联合的菌丝。在担孢子和节孢子中均发现有假丝状或丝状体细胞的存在。环境因子影响结果表明:氮源、碳源、碳氮比、pH值、温度、培养时间和香灰菌胞外液七种环境因子对银耳酵母型细胞向菌丝型细胞转换均有一定程度的影响,其中经过滤除菌的香灰菌胞外液在液体培养基中的影响效果最大,可使节孢子菌丝型的百分比高达9.89%、担孢子菌丝型的百分比达9.47%;碳氮比总体水平上影响较小,担孢子和节孢子在不同碳氮比条件下固体和液体培养时的菌丝型百分比均未超过2.4%。此外,各环境因子对酵母型细胞形态转换的影响因固体和液体培养环境的不同而呈现一定差别。总蛋白及同工酶差异分析表明:菌丝型细胞总蛋白谱带多于酵母型细胞,过氧化物酶及酯酶同工酶谱带与酵母型存在一定差异,而多酚氧化酶谱带基本相同。分别提取菌丝型和酵母型细胞的总RNA,应用RAP-PCR技术获得与银耳二型态细胞差异表达相关的两个基因片段,分别为Seq1和Seq2,Seq1与新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans var.neoformans）中的未知蛋白基因序列有较高的同源性,Seq2与棒曲霉（Aspergillus clavatus）中的未知蛋白基因序列有较高的同源性。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 部分英文缩写说明
  • 1 前言
  • 1.1 真菌二型态概述
  • 1.2 真菌二型态环境影响因子
  • 1.2.1 营养因子
  • 1.2.2 化学因子
  • 1.2.3 物理因子
  • 1.2.4 其它环境因子
  • 1.3 真菌二型态相关信号转导途径
  • 1.3.1 cAMP-PKA途径
  • 1.3.2 MAPK途径
  • 1.3.3 Rim101途径
  • 1.3.4 其它途径
  • 1.4 真菌二型态其它研究进展
  • 1.5 本课题研究的目的及意义
  • 2 实验材料及试剂
  • 2.1 菌株
  • 2.2 培养基
  • 2.3 主要实验仪器
  • 2.4 主要试剂及制备
  • 2.4.1 银耳二型态细胞环境影响因子研究相关试剂
  • 2.4.2 银耳二型态细胞同工酶差异研究相关试剂
  • 2.4.3 银耳二型态细胞总蛋白差异研究相关试剂
  • 2.4.4 银耳二型态细胞差异表达相关基因克隆试剂
  • 2.4.4.1 总RNA提取及纯化试剂
  • 2.4.4.2 反转录及RAP-PCR试剂
  • 2.4.4.3 核酸电泳分析试剂
  • 2.4.4.4 克隆试剂
  • 2.4.4.5 Northern杂交试剂
  • 3 实验方法
  • 3.1 银耳二型态细胞的获得及纯化
  • 3.2 银耳二型态细胞的形态观察
  • 3.3 银耳二型态细胞环境影响因子的研究
  • 3.3.1 菌种活化
  • 3.3.2 环境因子的影响
  • 3.4 银耳二型态细胞总蛋白差异研究
  • 3.5 银耳二型态细胞同工酶差异研究
  • 3.6 银耳二型态细胞差异表达相关基因的克隆
  • 3.6.1 总RNA的提取
  • 3.6.2 总RNA的纯化
  • 3.6.3 cDNA第一链合成
  • 3.6.4 RAP-PCR反应
  • 3.6.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色
  • 3.6.6 差异条带的回收、二次扩增及纯化
  • 3.6.7 差异基因片段的克隆
  • 3.6.7.1 感受态细胞的制备
  • 3.6.7.2 DNA片段连接
  • 3.6.7.3 转化
  • 3.6.7.4 阳性克隆的鉴定
  • 3.6.7.5 差异片段克隆测序及分析
  • 3.6.7.6 差异显示片段的特异扩增
  • 3.6.7.8 Northern杂交分析
  • 4 结果与分析
  • 4.1 银耳二型态细胞形态观察结果
  • 4.2 银耳二型态细胞显微观察结果
  • 4.3 环境因子对银耳二型态细胞形态转换影响结果
  • 4.3.1 氮源对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.3.2 碳源对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.3.3 碳氮比对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.3.4 pH值对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.3.5 培养温度对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.3.6 培养时间对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.3.7 香灰菌胞外液对银耳芽胞形态转换的影响
  • 4.4 银耳二型态细胞同工酶差异研究结果
  • 4.5 银耳二型态细胞总蛋白差异研究结果
  • 4.6 银耳二型态细胞差异表达相关基因的克隆研究结果
  • 4.6.1 总RNA提取及纯化结果
  • 4.6.2 RAP-PCR差异显示结果
  • 4.6.3 差异条带的回收及二次扩增结果
  • 4.6.4 差异片段克隆结果
  • 4.6.5 序列分析及同源性比对结果
  • 4.6.6 序列RT验证结果
  • 4.6.7 Northern杂交结果
  • 5 结论及讨论
  • 5.1 银耳二型态细胞形态差异
  • 5.2 环境因子对银耳二型态细胞形态转换的影响
  • 5.3 银耳二型态细胞同工酶差异
  • 5.4 银耳二型态细胞总蛋白差异
  • 5.5 银耳二型态细胞差异表达相关基因的克隆
  • 5.6 小结及展望
  • 发表论文
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

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