中华蜜蜂（Apis cerana cerana）MRJP2基因的原核表达

论文摘要

蜜蜂作为昆虫大家族中的一员,长期以来被视为一个很好的研究对象,而且一直是国内外研究的热点。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）为东方蜜蜂中重要的亚种之一,长期适应于我国的地理特征和气候条件,是我国特有的蜜蜂资源,具有其它蜂种不可替代的资源优势和研究价值。蜂王浆（Royal Jelly, RJ ）是哺育蜂咽下腺与上颚腺分泌的供3日龄以内蜜蜂幼虫和蜂王食用的浆状物质。蜂王浆已被报道具有多种医疗保健和生物学功能,对蜂王浆成分及其功能的研究一直是国内外蜂学研究的重要领域。蜂王浆的许多功能由其所含的蛋白组分产生,王浆蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成,其中水溶性蛋白占总蛋白含量的46%～89%,为王浆蛋白的主要部分,称为主要王浆蛋白（Major Royal Jelly Proteins, MRJPs）。目前,王浆蛋白分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族。我们从已构建的8日龄中蜂的工蜂头部cDNA文库中筛选到MRJP2基因,成功获得该基因的全长cDNA序列。此序列包含一个1407 bp的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）,编码一个由468个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为53.06 kDa,等电点为8.102。本研究首先通过PCR方法从AccMRJP2基因的全长cDNA序列中扩增出整个ORF,再经EcoR I/Xho I双酶切后将其插入经同样双酶切过的原核表达载体pET-28a（+）上,获得重组质粒pET-28a（+）-AccMRJP2,后通过PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒构建正确后,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达AccMRJP2重组蛋白,最后经SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况,结果显示无特异性条带出现,之后重复多次试验也没有检测到目的蛋白的表达,因此我们随后考虑对AccMRJP2基因进行分段克隆,同时也进行全长基因的表达作为对照。为了避免信号肽可能产生的负作用,我们在进行实验前先将存在于此基因中的信号肽序列去除,并根据需要设计出四对合适的引物,再经PCR扩增出各目的基因片段,长度分别为420 bp、486 bp、498 bp和1356 bp,随后分别构建重组质粒pET-28a（+）-AccMRJP2,并鉴定各重组子是否构建成功,再将各重组质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,最后经IPTG诱导表达带His标签的AccMRJP2各片段的融合蛋白及全蛋白,并将其分别命名为His-420、His-486、His-498和His-1356,对应的分子量分别为19.7 kDa、21.5 kDa、22.4 kDa和54.8 kDa（融合标签3.56 kDa）。SDS-PAGE检测各融合蛋白的表达情况,结果发现His-420、His-486和His-498均出现各自的特异性条带,但都是以包涵体的形式出现;而His-1356没有出现特异性条带,随后也进行了多次重复实验,始终没有发现目的蛋白的表达。为了进一步探索每种蛋白的最适表达条件,我们也对各融合蛋白的表达条件进行了优化,分别设计了9组在不同诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度条件下的表达实验,同样经SDS-PAGE检测各融合蛋白的表达情况。结果显示,将诱导温度从30°C上升到37°C有利于提高His-420融合蛋白的表达量,而对其它两种蛋白无明显影响;改变IPTG浓度对三种蛋白的表达量影响均不大;此步实验更进一步确定了三种融合蛋白都是以包涵体的形式出现的。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化各融合蛋白,得到的目的蛋白纯度均较高,再经FPLC反相层析柱进一步纯化,最后进行LC-MS质谱分析。质谱结果显示三种融合蛋白均属于AccMRJP2基因的表达产物;另外,纯化的His-420、His-486和His-498经酶解得到的小肽段中,存在有与已报道降血压二肽Ile-Phe （IF, MW=278 Da）分子量接近的肽段,该结果表明AccMRJP2基因分段克隆表达出的三种蛋白的酶解肽段可能成为抗高血压肽的来源之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 略语表
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1 蜂王浆的组成及其功能
• 1.1 蜂王浆的物理性质和化学成分
• 1.2 蜂王浆的功能
• 2 王浆蛋白概述
• 2.1 主要王浆蛋白
• 2.2 其余王浆蛋白
• 3 研究目的与意义
• 4 主要研究内容
• 5 实验流程图
• 第二章 AccMRJP2 全长基因的原核表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 AccMRJP2 全长基因的克隆
• 2.1.1 AccMRJP2 基因cDNA 全长序列的获得
• 2.1.2 AccMRJP2 基因的生物信息学分析
• 2.1.2.1 序列分析
• 2.1.2.2 疏水性分析
• 2.1.2.3 信号肽分析
• 2.1.2.4 跨膜结构域预测
• 2.1.2.5 定位预测
• 2.1.2.6 氨基酸序列的同源性分析
• 2.1.3 PCR 扩增AccMRJP2 全长基因
• 2.1.3.1 特异性引物的设计与合成
• 2.1.3.2 PCR 扩增
• 2.1.4 凝胶回收纯化PCR 产物
• 2.1.5 目的片段与pET-28a（+）载体的双酶切及回收
• 2.1.6 连接反应
• 2 法制备E.coli DH5α感受态细胞'>2.1.7 CaCl₂ 法制备E.coli DH5α感受态细胞
• 2.1.8 连接产物的转化
• 2.1.9 重组质粒pET-28a（+）-AccMRJP2 的筛选与鉴定
• 2.1.9.1 挑斑与质粒抽提
• 2.1.9.2 PCR 鉴定重组质粒
• 2.1.9.3 双酶切鉴定重组质粒
• 2.1.9.4 重组质粒测序鉴定
• 2.1.9.5 序列比对分析
• 2.2 AccMRJP2 基因全长的诱导表达
• 2 法制备E.coli BL21（DE3）感受态细胞'>2.2.1 CaCl₂ 法制备E.coli BL21（DE3）感受态细胞
• 2.2.2 重组质粒的转化
• 2.2.3 重组质粒pET-28a（+）-AccMRJP2 的筛选与鉴定
• 2.2.3.1 挑斑、摇菌
• 2.2.3.2 菌液PCR 鉴定
• 2.2.4 His-AccMRJP2 重组蛋白的诱导表达
• 2.2.5 SDS-PAGE 电泳检测
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增目的基因
• 3.2 重组质粒pET-28a（+）-AccMRJP2 的鉴定
• 3.3 His-AccMRJP2 重组蛋白的诱导表达
• 4 讨论
• 第三章 AccMRJP2 基因的分段原核表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 AccMRJP2 基因的分段克隆
• 2.1.1 AccMRJP2 基因的cDNA 全长序列的获得
• 2.1.2 PCR 扩增AccMRJP2 基因的各段序列
• 2.1.2.1 特异性引物的设计与合成
• 2.1.2.2 PCR 扩增
• 2.1.3 凝胶回收纯化PCR 产物
• 2.1.4 各目的片段与pET-28a（+）载体的双酶切与回收
• 2.1.5 连接反应
• 2 法制备E.coli DH5α感受态细胞'>2.1.6 CaCl₂ 法制备E.coli DH5α感受态细胞
• 2.1.7 连接产物的转化
• 2.1.8 各重组质粒的筛选与鉴定
• 2.1.8.1 挑斑与质粒抽提
• 2.1.8.2 PCR 鉴定各重组质粒
• 2.1.8.3 双酶切鉴定重组质粒
• 2.1.8.4 重组质粒测序鉴定
• 2.1.8.5 序列比对分析
• 2.2 AccMRJP2 基因的分段诱导表达
• 2 法制备E.coli BL21（DE3）感受态细胞'>2.2.1 CaCl₂ 法制备E.coli BL21（DE3）感受态细胞
• 2.2.2 重组质粒的转化
• 2.2.3 各重组质粒的筛选与鉴定
• 2.2.3.1 挑斑、摇菌
• 2.2.3.2 菌液PCR 鉴定
• 2.2.4 融合蛋白His-420、His-486、His-498 和His-1356 的诱导表达
• 2.2.5 SDS-PAGE 电泳检测
• 2.3 诱导表达条件的优化
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增各目的基因
• 3.2 各重组质粒的构建
• 3.3 融合蛋白His-420、His-486、His-498 和His-1356 的诱导表达
• 3.3.1 不加诱导剂（IPTG）的融合蛋白His-498 和His-1356 的表达
• 3.3.2 加诱导剂（IPTG）的融合蛋白His-498 和His-1356 的表达
• 3.3.3 融合蛋白His-420 和His-486 的表达
• 3.4 融合蛋白诱导表达条件的优化
• 3.4.1 His-498 融合蛋白表达条件的优化
• 3.4.2 融合蛋白表达条件的优化
• 4 讨论
• 第四章 AccMRJP2 重组蛋白的纯化及质谱分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 重组蛋白的亲和纯化
• 2.1.1 重组蛋白的表达存在形式分析
• 2.1.2 包涵体的溶解
• 2.1.3 Ni-NTA 柱亲和纯化重组蛋白
• 2.1.4 Ni-NTA 亲和层析柱的再生
• 2.2 重组蛋白的FPLC 纯化和质谱分析
• 2.2.1 重组蛋白的FPLC 纯化
• 2.2.2 重组蛋白的鉴定
• 2.2.3 重组蛋白的酶解
• 2.2.4 重组蛋白酶解肽段的质谱分析
• 3 结果
• 3.1 重组蛋白的大量表达及包涵体的处理
• 3.1.1 His-420 和His-498 包涵体的处理
• 3.1.2 His-486 包涵体的处理
• 3.2 His-420、His-486 和His-498 融合蛋白的纯化
• 3.2.1 His-486 融合蛋白的纯化
• 3.2.2 His-498 融合蛋白的纯化
• 3.3 FPLC 纯化及质谱分析
• 3.3.1 重组蛋白的质谱鉴定
• 3.3.2 重组蛋白酶解多肽的质谱分析结果
• 3.3.2.1 His-420 融合蛋白的质谱图
• 3.3.2.2 His-486 融合蛋白的质谱图
• 3.3.2.3 His-498 融合蛋白的质谱图
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢