亚硝酸乙酯的细胞毒性作用及可能机制探讨

论文摘要

亚硝酸乙酯（Ethyl nitrite/O-nitrosoethanol,ENO）,是一种广泛存在于食品中的有机物,也是有机化学工艺中常见的中间产物。尽管人们对它的认识已有百余年的历史,但其在医学方面的研究却极少报道。ENO作为一个古老的有机化合物,它引起医学科研工作者的注意与一氧化氮（nitric oxide,NO）在医学方面的研究进展有着极大的关联。 1992年Kinsellla等首次报道吸入NO（inhaled nitric oxide,iNO）治疗新生儿持续性肺动脉高压（persistent pulmonary hypertension of the newborn,PPHN）取得良好临床效果,此后iNO逐渐成为医学研究的一个热点。尽管大量的临床和实验研究都提示了iNO在治疗肺动脉高压和急性肺损伤的中的良好疗效,这些研究同时也发现了iNO的诸多副作用,其中犹为突出的两个毒副作用是:1、NO易与氧及超氧阴离子（O2/O2-）反应形成有害的氮氧化合物（NOx）,后者可通过髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）作用等氧化途径使蛋白硝基化及造成氧化应激损害等;2、NO吸入的中止常引起肺动脉高压的“返跳”（rebound）现象。 与吸入NO不同的是,内源性NO产生后,除通过与血管内皮细胞的作用直接调节血管扩张外,另有部分可共价结合硫醇如谷胱甘肽、半胱氨酸和血红蛋白等,发生亚硝化反应以亚硝基硫醇（S-Nitrosothiols,SNOs）的形式贮存于细胞内。人体内SNOs主要包括亚硝酰基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione,GSNO）、浙江大学硕士学位论文亚硝酞基半肤氨酸（S一nitrosoeysteine,CsNO）及亚硝酞基血红蛋白（s一nitrosohemoglobin,SNO一Hb）等。sNOs的形成,既避免T NO与02/02‘的结合,又可随血循环氧饱和度的高低及组织中O:梯度变化来调节NO水平从而发挥调节血管张力的作用。 为了模拟内源性NO的特性,Duke大学的Stamler教授领导的小组筛选出了ENO这种有机物。由于ENO的沸点低（17℃）常温下能气化,因此其可作为一种候选气体用作吸入研究。ENO的基本特性是在O:存在下不易降解（在100%O:中稳定）、能与谷肤甘肤反应生成GSNO、不易对血红蛋白氧化及有很好的生物兼容性。对于ENO的初步研究发现,腹腔境手术过程中用ENO混合COZ吹入腹腔,可显著减轻手术过程中腹腔脏器血流的减少,显示了ENO可选择性扩张血管的作用;而用ENO吸入治疗肺动脉高压,也显示了其有选择性扩张肺血管及改善氧合的作用,与传统的一氧化氮吸入治疗相比,它无明显的“返跳”现象及毒性产物（如NO、）产生。这些初步研究成果提示ENO将可能成为继NO’后吸入治疗的新的研究方向。 由于ENO在医学方面的研究尚处于起步阶段,不管是动物或临床实验中,其应用的适宜剂量及毒性作用均无明确报道,所以本课题拟用细胞培养的方法,通过研究不同浓度不同作用时间ENO对V79细胞生存率的影响,以了解ENO的细胞毒性作用;并通过研究增加/消耗还原型谷肤甘肤（GSH）对ENO细胞毒性的影响及ENO对细胞凋亡影响来探讨ENO产生毒性作用的可能机制。我们期望通过本课题的研究,为今后实验中ENO应用剂量的选择提供依据,并为进一步研究其毒性提供思路。第一部分亚稍酸乙醋的细胞毒性作用研究目的: 研究不同浓度不用作用时间ENO对V79细胞生存率的影响,探讨ENO可能存在的细胞毒性作用。浙江大学硕士学位论文方法:l、ENO的合成、提纯和纯度测定: 合成:常温下,浓硫酸缓慢滴定亚硝酸钠、乙醇和水的混合溶液,产生气体 经冷凝后收集。 提纯:制得的液体状态ENO室温下经反复气化冷凝而纯化。 纯度测定:气相色谱法。2、细胞培养:常规细胞培养。3、MTT法研究不同浓度不同作用时间ENO对V79细胞生存率的影响（重复3次）。 研究6个ENO浓度0、0.0001%、0.0005%、0.0025%、0.0125%、0.0625%作用4h、sh、12h、24h对V79细胞生存率的影响,同时设空白对照组,以该组生存率为100%。4、乳酸脱氢酶法进一步确定0.0125%ENO作用4h的毒性作用。 设空白对照组:单加培养基作用4h; 对照组:加含l%乙醇的培养基作用4h; ENO组:加含0.0125%的ENO处理4h。结果:I、ENO测定结果:ENO+乙醇99.7337%。2、MTT结果: （1）、不同浓度ENO对细胞生存率影响 作用4h时,0.0125%和0.0625%组与0浓度组比较生存率均显著下降（P<0.01）,0.0625%组较0.0125%组生存率更进一步下降（p<0.01）;作用sh、12h和24h时,0.0025%、0.0125%和0.0625%组较0浓度组生存率均显著下降 （P<0 .01）,该三组间随浓度增加生存率逐渐下降（P均<0.01）。 （2）、不同时间对细胞生存率的影响 O、0.0001%和0.0005%组,24h内各时间点无显著差异;0.0025%组,sh浙江大学硕士学位论文 生存率较4h显著下降（P<0.05）,12h和sh无显著差异,24h较12h生存率更 进一步下降（P<0.01）;0.0125%组,8h生存率较4h显著下降（P<0 .01）,12h 和8h无显著差异,24h较12h生存率更进一步下降（P<0 .01）;0.0625%组8h 较4h生存率显著下降（P<0.01）,12h较sh生存率更进一步下降（P<0.01）,24h 和12h无显著差异。 3、LDH结果:0.0125%ENO作用4h后培养上清LDH显著增高（P<0.05）。 结论: 1、成功合成并提纯ENO。 2、ENO具有一定细胞毒性,其毒性具有一定的浓度依赖性和时间依赖性。一 次性给予0.0125%的E

论文目录

• 一.缩略词
• 二.中文摘要
• 三.英文摘要
• 四.正文
• 前言
• 第一部分
• 第二部分
• 五.综述
• 亚硝基硫醇研究进展
• 六.附录：在读期间发表文章
• 一氧化氮吸入和重组人超氧化物歧化酶对胎粪吸入肺损伤后肺组织纤维化指标的观察 中国病理生理杂志，2005，21（3）：604—606
• 七.致谢