鱼腥藻PCC7120cpcS2基因的初步研究与CpcS1和CpcT1抗体的制备

论文摘要

藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族,蓝藻藻胆蛋白生物合成的最后一步为色素与脱辅基蛋白的连接。藻胆色素的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。在蓝藻Anabaena sp.PCC 7120中,CpcS1作为藻胆蛋白裂合酶可催化CpcB中Cys-84与藻蓝胆素（PCB）的连接。Zhao等通过同源性分析,在鱼腥蓝藻基因组中发现了与其同源性较高的编号为all5292的基因cpcS2,但研究显示其并不具备藻胆蛋白裂合酶活性,且其基因的表达受到氮剥夺条件的诱导。本研究利用分子克隆方法克隆了包含有同源臂的cpcS2基因片段,通过合适的酶切位点带入链霉素抗性基因后构建了重组整合载体pRL271-L-cpcS2-str-R并转入到大肠杆菌HB101中,经三亲本杂交转化丝状鱼腥藻PCC 7120,用含壮观霉素的BG11平板筛选得到了具有壮观霉素抗性的单交换重组藻株。对比野生藻,单交换重组藻的表型变化明显。同时,本实验利用克隆重组的原核表达载体pET-cpcS1、pET-cpcT1在大肠杆菌中大量表达蛋白后,经粗分离和亲和柱层析提纯获得了大量可溶的重组融合CpcS1、CpcT1蛋白,用其分别免疫家兔后制备了两个蛋白的抗血清。免疫印迹结果表明原核表达的CpcS1、CpcT1蛋白具有较好的免疫原性,所制备的抗血清对CpcS1和CpcT1蛋白均有较高的免疫效价和特异性,但与CpcS2和CpcT2蛋白存在部分的免疫交叉反应。此外,本实验还对cpcS2基因的启动子进行了初步的分析。通过改造蓝藻穿梭质粒载体pHB912,插入绿色荧光蛋白gfp报告基因,构建了融合质粒穿梭载体pHB912-cpcS2P-gfpA并转化鱼腥蓝藻PCC 7120。初步分析结果显示cpcS2基因起始密码子前539bp的DNA片段不具备有起始cpcS2基因表达的功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 鱼腥藻PCC7120 的研究背景
• 1.2 鱼腥藻PCC7120 的遗传操作
• 1.2.1 蓝藻基因工程载体
• 1.2.2 蓝藻外源基因转化的方法
• 1.2.3 影响蓝藻转化效率的因素
• 1.2.4 鱼腥藻PCC7120 突变株的分离
• 1.3 藻胆蛋白裂合酶
• 1.3.1 光合作用
• 1.3.2 藻胆蛋白
• 1.3.3 藻胆蛋白的生物合成
• 1.4 基因的转录调控
• 1.4.1 启动子
• 1.4.2 鱼腥藻PCC7120 中启动子的研究
• 1.4.3 启动子的研究方法
• 1.4.4 报告基因的研究进展
• 1.4.5 启动子表达特征的研究方法
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 鱼腥藻PCC 7120 cpcS2 缺失体的构建与筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株、质粒及培养条件
• 2.2.2 主要的分子生物学试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 实验设计
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.5.1 PCC7120 藻总DNA 的提取
• 2.2.5.2 碱裂解法大量制备质粒DNA
• 2.2.5.3 大肠杆菌感受态细胞制备和转化
• 2.2.5.4 引物设计与测序
• 2.2.5.5 目的片段的PCR 扩增
• 2.2.5.6 从琼脂糖凝胶中回收DNA
• 2.2.5.7 DNA 的限制性内切酶消化
• 2.2.5.8 PCR 技术引导的定点突变
• 2.2.5.9 三亲本接合转移鱼腥藻
• 2.2.6 cpcS2 突变体的构建与筛选
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 第3章 鱼腥藻PCC 7120 CpcS1 和CPCT1 抗血清的制备
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 主要材料与试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 蛋白质的大量表达和细胞的超声破碎
• 3.2.4.2 透析袋的预处理
• 3.2.4.3 亲和柱层析和透析纯化蛋白
• 3.2.4.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.4.5 蛋白质浓度的测定
• 3.2.4.6 动物免疫和抗血清的获得
• 3.2.4.7 Western Blotting 检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 同源性分析
• 3.3.2 CpcS1 和CpcT1 蛋白提纯
• 3.3.3 提纯蛋白的浓度测定
• 3.3.4 抗血清的效价和特异性
• 3.4 讨论
• 第4章 鱼腥藻PCC 7120 cpcS2 启动子初步分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株与质粒
• 4.2.2 主要材料与试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 实验设计
• 4.2.5 实验方法
• 4.2.5.1 质粒DNA 的操作
• 4.2.5.2 5’末端的去磷酸化反应
• 4.2.5.3 5’端的补平反应
• 4.2.5.4 引物合成与测序
• 4.2.5.5 电击转化鱼腥蓝藻
• 4.2.6 cpcS2 基因启动子分析
• 4.2.6.1 克隆可能的启动子片段
• 4.2.6.2 绿色荧光蛋白的原核表达
• 4.2.6.3 穿梭质粒pHB912 的改造
• 4.2.6.4 cpcS2P 与穿梭质粒的整合与鉴定
• 4.2.6.5 三亲本杂交转化鱼腥蓝藻与筛选
• 4.3 结果与讨论
• 实验的总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文
• 附录B 缩略词（Abbreviation）一览表