王不留行抑制人微血管内皮细胞有效部位的分离纯化及其药效评价

论文摘要

背景与目的:肿瘤血管生成为肿瘤恶性生长和转移提供营养和途径,因此抑制肿瘤血管生成是肿瘤生物防治新策略,引起了极大的兴趣和关注,目前数十种针对肿瘤血管形成的分子机制所设计的抗血管生成剂已进入临床试验。人微血管内皮细胞(HMEC)在血管发生中具有重要作用,内皮细胞由骨髓源原祖细胞分化而来,其分化的过程复杂,受到多种因素调控,目前还不能清楚的解释具体的调控过程。通过抑制内皮细胞增殖可以抵抗肿瘤血管生成,进而抑制肿瘤的恶性生长和转移。本研究拟采用内皮细胞模型从中药库中筛选具有抗血管生成的中药,对其水煎剂进行体内体外药效学鉴定,同时分离纯化具有抑制内皮细胞增殖的有效单一组分,然后对该组分进行体外药效学评价。研究方法:将中药材水煎剂经大孔树脂吸附进行总皂苷的分离纯化,分别收集不同浓度乙醇溶液洗脱液,用SRB(磺酰罗丹明B)法进行细胞活性检测,选择有效部分用AKTA resource柱分离,按紫外吸收峰收集洗脱液并进行活性验证,蒸发光散射检测组分复杂程度,选择活性高、丰度大、成份简单的峰进行C18柱分离。通过改变流动相和色谱柱进行分离条件优化,同时按等体积分段收集有效部位,进行细胞活性检测和HPLC分析。SRB细胞增殖抑制法测定IC50值;通过控制药物作用时间确定时间与药效关系;划线灼伤法研究细胞迁移;体外基质胶细胞黏附实验分析提取物对细胞黏附能力的影响;HE染色观察药物对细胞染色体的影响。结果:王不留行水煎剂经大孔树脂分离和细胞活性检测发现50%~70%乙醇浓度洗脱液具有细胞活性,经AKTA resource柱分离得(0~6)七种组份群,细胞活性测得(3~6)号组分有活性,选择4号组分经C18柱分离得五组分(A~E),组分B为有紫外吸收的主峰,但无细胞活性,其活性分布于组分D和组分E中。组分D经蒸发光散射检测为单峰,而组分E包含有4中化合物,鉴于组分E具有很高的细胞活性和丰度,因此对其进一步分析,通过添加甲酸改变流动相pH值可以明显改善分离效果,用乙腈代替甲醇也能使组分E按基线分离。通过SRB法测定组分E的IC50值为3.60μg/ml,时间与药效关系表明加药后4h药效起作用。迁移实验表明加药48h后加药组的细胞迁移受到明显抑制,其迁移率为40.33%,对照组迁移率为77.68%(P<0.05)。细胞黏附实验表明加药组细胞黏附受到明显抑制,且呈浓度依赖关系。结论:经上述方法筛选出王不留行具有抗血管生成活性,其水煎剂具有明显的新生血管抑制作用。通过对其水煎剂进行分离纯化获得了单一组分群,该组分呈白色晶体,极易溶液水。体外细胞水平评价该组分群具有极强的细胞增殖抑制活性,同时对细胞迁移和黏附能力也具有抑制作用,因此该组分群具有潜在的价值用于抗肿瘤血管生成药物开发。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 肿瘤现状
• 1.1.2 血管生成研究
• 1.1.2.1 血管生成概述
• 1.1.2.2 内皮细胞及其相关生长因子
• 1.1.2.3 肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用
• 1.1.2.4 血管生成抑制剂
• 1.1.3 肿瘤与血管生成关系
• 1.1.4 中药抗血管生成研究
• 1.2 本研究前期工作
• 1.2.1 王不留行水煎剂对人血管内皮细胞增殖的抑制作用
• 1.2.2 王不留行水煎剂血清药效学作用分析
• 1.2.3 王不留行水煎剂对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用
• 1.2.4 王不留行水煎剂体内Matrigel plug 法血管抑制试验结果
• 1.2.5 王不留行水煎剂Lewis 肺癌转移的抑制作用
• 1.3 本研究目的和内容
• 第二章 王不留行抑制内皮细胞有效成分的分离纯化及其HPLC 检测分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 细胞增殖抑制实验从中药库中筛选目的物
• 2.3.3 大孔树脂吸附分离以及不同浓度乙醇洗脱效率的考察
• 2.3.4 反相resource 柱中压分离有效组分的研究
• 18 色谱柱分离纯化'>2.3.5 反相resource 柱分离得到的有效部位用制备型C₁₈色谱柱分离纯化
• 18 色谱柱各段分离组分细胞抑制活性评价'>2.3.6 反相resource 柱和制备型C₁₈色谱柱各段分离组分细胞抑制活性评价
• 18 色谱柱各段分离组分的色谱峰复杂度'>2.3.7 蒸发光散射检测器检测反相resource 柱和制备型C₁₈色谱柱各段分离组分的色谱峰复杂度
• 2.3.8 组分E 的进一步分析及其活性检测
• 2.3.8.1 分段收集组分E 及其细胞活性评价
• 2.3.8.2 组分E 各分段部位ELSD 分析
• 2.3.8.3 组分E 全波长扫描
• 18 柱对检测结果的影响'>2.3.8.4 不同分析型C₁₈柱对检测结果的影响
• 2.3.8.5 不同流动相对组分E 分离结果的影响
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 大孔树脂经不同浓度乙醇洗脱效率
• 2.4.2 反相resource 柱中压分离结果、细胞活性评价和ELSD 检测
• 2.4.2.1 反相resource 柱中压分离图谱及分段收集结果
• 2.4.2.2 反相resource 柱各段分离组分的活性检测（SRB 法）
• 2.4.2.3 ELSD 检测器检测反相resource 柱各段分离组分的色谱峰复杂度
• 18 色谱柱分离纯化、细胞活性评价和ELSD 检测'>2.4.3 制备型C₁₈ 色谱柱分离纯化、细胞活性评价和ELSD 检测
• 18 色谱柱分离图谱及分段收集结果'>2.4.3.1 制备型C₁₈色谱柱分离图谱及分段收集结果
• 18 色谱柱各分离组分的活性检测（SRB 法）'>2.4.3.2 C₁₈ 色谱柱各分离组分的活性检测（SRB 法）
• 18 柱各段分离组分的色谱峰复杂度'>2.4.3.3 ELSD 检测器检测C₁₈柱各段分离组分的色谱峰复杂度
• 2.4.4 组分E 的进一步分析及其活性检测结果
• 2.4.4.1 组分E 分段收集结果及其细胞活性评价
• 2.4.4.2 组分E 各分段部位ELSD 分析
• 2.4.4.3 全波长扫描结果
• 18 柱对检测结果的影响'>2.4.4.4 不同分析型C₁₈柱对检测结果的影响
• 2.4.4.5 不同流动相对组分群E 分离结果的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 王不留行单一有效组分体外药效学评价
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 50 值'>3.3.1 SRB 法测定IC₅₀值
• 3.3.2 细胞迁移实验
• 3.3.3 细胞黏附实验
• 3.3.4 时间与药效关系
• 3.3.5 HE 染色观测细胞形态变化
• 3.3.6 统计分析
• 3.4 结果与讨论
• 50 值的测定'>3.4.1 组分E 对内皮细胞IC₅₀值的测定
• 3.4.2 组分E 对细胞迁移的作用效果
• 3.4.3 组分E 对细胞黏附的作用结果
• 3.4.4 时间与药效关系
• 3.4.5 组分E 对细胞形态的影响
• 3.5 本章小结
• 论文总结及展望
• 一、主要结论
• 二、存在问题及展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文