中国大陆湖北钉螺不同地理景观群体遗传变异分析

论文摘要

日本血吸虫病（Schistosomiasis）作为人畜共患的寄生虫病,严重危害着人类的健康,成为我国现今面临的重要公共卫生问题之一。湖北钉螺（Oncomelania hupensis）是日本血吸虫（Schistosoma japonicum）唯一的中间宿主,其地理分布与日本血吸虫病流行区具有严格的一致性,在日本血吸虫病的传播过程中起着关键作用。湖北钉螺主要分布于东南亚地区,在我国主要分布于长江流域,北起北纬33°20’,南抵北纬22°20’,东至东经121°51’,西达东经99°04’,包含了我国的12个省、市、自治区。生存环境差异较大,对湖北钉螺群体产生了严重的地理隔离,湖北钉螺群体之间发生了遗传分化和变异,在不同的地理环境中形成了多个地理种型,对日本血吸虫的易感性也不尽相同。因此,湖北钉螺种下分型和种群遗传分化的深入研究,为研究日本血吸虫和湖北钉螺的相互作用、钉螺群体扩散机制、血吸虫病流行病学、血吸虫病低感染率情况下的主动监测工作具有重要理论指导意义。本研究首先比较了五种常用的基因组抽提方法抽提湖北钉螺基因组并扩增mtDNA中细胞色素C氧化酶Ⅱ来比较抽提、扩增效果,目的是为了寻求一种适合湖北钉螺大批量抽提扩增的方法,其次,在实验室获得湖北钉螺线粒体全基因组序列的基础上,设计出16对特异性引物扩增13个采集点的全线粒体基因组序列,并对其序列信息进行分析,然后截取各地13个线粒体蛋白编码基因并从中筛选出系统发育信息较好和中等的分子标记,用于后续的群体遗传研究,同时还研究了在湖北钉螺群体遗传分析中,使用线粒体分子作为标记的群体取样策略,最后通过分析mtDNA细胞色素C氧化酶Ⅱ和脱氧核糖氧化酶亚基3在景观水平上的群体遗传结构探寻中国大陆湖北钉螺不同地理景观群体在分子水平上的特异特征,分析中国大陆不同地理景观与湖北钉螺群体遗传多样性的关系、迁徙和分化。获得结果如下：（1）5种基因组抽提方法都能抽提出湖北钉螺基因组,并能进行mtDNA-COⅡ的PCR扩增,在具体实验中五种方法在实验效果和应用价值上表现出较大的差异。试剂盒方法抽提的基因组抽提精度较高,但使用成本太高,操作易出现人为误差,样本量少、精度要求较高的实验多采用这种方法；简化方法抽提试剂简单,操作步骤少,减少了DNA的损失,简便易行,快速经济,保证了所提DNA的完整性和纯度,更适合对大量样品的提取。（2）本研究获得的12条完整的线粒体基因组全序列,长度在15183 kb到15216kb。湖北钉螺各线粒体蛋白编码基因系统发育信息不同,大致分为好中差三个等级,其中COⅠ、ND2、ND5、ND3分类较好,COⅡ、ATP6、ND1、Cytb、ND4次之,而ATP8、ND6、COⅢ、ND4L较差。（3）湖北钉螺线粒体ND3基因在不同地理群体间表现出不同的基因多态性,且并未表现出基因多态性随着样本量的增多而增多；却表现出明显的地域差异；因此,在ND3基因的群体遗传研究中的样本量范围应为10-30之间。（4）基于线粒体ND3基因和COⅡ基因的分子序列特征将我国大陆湖北钉螺群体分为4个主要类群,长江中下游群体、云南和四川高山型群体、广西内陆山丘型群体和福建沿海山丘型群体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 景观遗传学概述
• 1.1 定义
• 1.2 与相近学科的比较
• 1.3 景观遗传学的研究内容
• 1.4 景观遗传学的研究方法
• 1.5 景观遗传学的研究进展
• 2 湖北钉螺研究进展
• 2.1 我国湖北钉螺分布类型
• 2.2 湖北钉螺全线粒体基因组研究概况
• 2.3 湖北钉螺群体遗传变异研究
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 湖北钉螺基因组五种抽提方法比较研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料及来源
• 2.1.2 主要仪器、试剂及耗材
• 2.1.3 基因组DNA的提取
• 2.1.4 基因组DNA电泳检测
• 2.1.5 用分光光度计测样品的OD值和浓度
• 2.1.6 PCR扩增COⅡ基因并凝胶电泳检测
• 2.1.7 PCR产物拷贝数的测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 各种抽提方法所需要的时间及其成本
• 2.2.2 钉螺基因组DNA的琼脂糖电泳检测
• 2.2.3 PCR产物检测结果
• 2.2.4 不同方法各样本的PCR拷贝数浓度相对值
• 2.3 分析与讨论
• 第三章 基于线粒体基因组全序列的湖北钉螺起源分化研究及线粒体DNA分子标记的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器、试剂及耗材
• 3.1.3 方法
• 3.1.4 mtDNA扩增及测序
• 3.1.5 序列拼接和组装
• 3.1.6 生物信息学分析
• 3.1.7 分类准确率的计算
• 3.1.8 拓扑距离的计算
• 3.2 结果
• 3.2.1 线粒体DNA的长片段扩增
• 3.2.2 基于线粒体基因组全序列的系统发育分析
• 3.2.3 线粒体DNA分子标记系统发育效率分析
• 3.3 分析与讨论
• 第四章 基于MTDNA分子标记的湖北钉螺群体遗传学研究中取样策略分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要仪器、试剂及耗材
• 4.1.3 基因组DNA的提取
• 4.1.4 PCR扩增及测序
• 4.1.5 序列分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 PCR扩增和测序结果
• 4.2.2 ND3基因序列分析
• 4.2.3 基因序列多态性与样本量关系
• 4.2.4 基因多态性与地理分布的关系
• 4.3 分析与讨论
• 第五章 应用MTDNA-ND3、MTDNA-COⅡ基因序列研究湖北钉螺不同景观群体遗传结构
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料及来源
• 5.1.2 主要仪器、试剂及耗材
• 5.1.3 湖北钉螺基因组DNA的提取
• 5.1.4 mtDNA-ND3和COⅡ基因扩增
• 5.1.5 扩增产物检查
• 5.1.6 序列纯化及测定
• 5.1.7 数据分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 ND3和COⅡ基因的PCR扩增和测序结果
• 5.2.2 各群体中获得2个基因的个体数目
• 5.2.3 ND3基因和COⅡ基因序列各景观群体单倍型的分布
• 5.2.4 基因的群体遗传分析
• 5.2.6 双参数距离分析
• 5.2.7 系统发育树
• 5.2.8 单倍型网络图
• 5.3 分析与讨论
• 第六章 小结
• 参考文献
• 附录:主要仪器和试剂
• 致谢
• 攻读硕士学位期间研究成果