论文摘要
正常角膜是透明无血管的,周围血管止于角膜缘。在感染、外伤或免疫反应等病理状态下,毛细血管由角膜缘向角膜内生长,形成角膜新生血管（cornealneovascularization CNV）。虽然新生血管对清除炎症、伤口愈合、抑制角膜融解等有一定促进作用,但角膜新生血管可严重影响视力,破坏角膜正常微环境而使前房相关免疫偏离（anterior chamber-associated immune deviation）消失,从而显著增加角膜移植术后的排斥发生率,排斥率可高达90%。在我国,仅眼外伤所致的CNV就约占整个角膜疾病的10%。就上海地区而言,复旦大学眼耳鼻喉科医院每年所进行的500多例各类角膜手术中,超过2/3的患者有角膜新生血管。另外,还有不少患者因严重的角膜血管化而失去手术机会。虽然科研人员进行了大量的实验与临床研究,角膜新生血管引起的失明及其伴随的角膜移植术后的高排斥率仍然是眼表疾病领域急待解决的棘手问题。新生血管主要由三部分构成:内皮细胞、周细胞和基底膜。其形成的实质是内皮细胞增殖、迁移和重组的过程。血管发生的步骤为:a)血管内皮细胞、周细胞的活化;b)基底膜的降解;c)活化血管内皮细胞、周细胞的迁移与增生;d)新生毛细血管腔的形成;e)新生毛细血管周边周细胞的出现;f)新生基底膜的形成;g)毛细血管环的形成。既往的研究表明,在错综复杂的调控机制中,血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor VEGF）被认为是新生血管发生、发展中起关键作用的因子。在病理情况下,VEGF异常高表达,导致其靶细胞血管内皮细胞的增殖和活化。活化的内皮细胞分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）等降解基底膜和细胞外基质,使自身游离并开始迁移,从而引起新生血管的出芽生长。因此,各种治疗角膜新生血管的靶点也集中在抑制血管内皮细胞的增殖、迁移方面。多种针对VEGF途径的抗新生血管治疗取得了一定的成效。但是在新生血管形成的晚期,阻断VEGF途径并不能有效抑制已形成的新生血管。由于抗VEGF治疗新生血管的局限性,血管周细胞在血管形成中的作用和意义逐渐为人们所重视。根据Cursiefen对196例新生血管化角膜的病理研究结果显示,在新生血管形成的2周左右,约80%的新生血管有周细胞包裹。基础研究表明,血管内皮细胞分泌血小板衍生因子-B（PDGFB）,而周细胞的胞膜上有PDGFR-β受体。通过PDGFB与受体结合,周细胞被募集在血管内皮细胞周围,与此同时周细胞可分泌VEGF,通过旁分泌的方式作用于血管内皮细胞,以维持血管内皮细胞的稳定。两种细胞相互作用实现“共生”。周细胞的出现,是新生血管“成熟”的标志。在这个阶段,血管内皮细胞对外源性VEGF的依赖大大降低。这也是在新生血管形成的晚期,单纯通过抑制VEGF通路疗效不佳的原因之一。另外,血管内皮细胞和周细胞还通过彼此间直接接触进行调节,通过这种调节,周细胞可对血管生成起控制作用。因此,通过阻断PDGFB的信号转导,抑制血管周细胞在内皮细胞外的集聚,使周细胞与内皮细胞失去接触,失去周细胞支持的内皮细胞,一旦失去VEGF的刺激将发生细胞凋亡,而最终导致新生血管退化。这个推论在抑制肿瘤新生血管方面得到初步证实。VEGF和PDGFB通过其相应受体发挥生物学效应。这两类都是跨膜受体,其胞内段有酪氨酸激酶结构域,属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases,RTKs）超家族。近年来针对酪氨酸激酶这个位点研发出很多颇具临床应用前景的小分子化合物,这些药物通过抑制受体的磷酸化,阻断相应的信号传导,达到抑制VEGF或PDGFB的生物学效应的目的。这些药物在抗肿瘤血管方面取得令人鼓舞的效果,但很少被用来治疗角膜新生血管。本实验选取两种酪氨酸酶抑制剂,针对不同时期小鼠角膜新生血管,采用单纯或联合抑制VEGF和PDGFB信号通路的方法,观察其对角膜新生血管的治疗作用。目的:观察小鼠角膜新生血管中周细胞出现的时间及形态特点。方法:通过碱烧伤及机械刮除全角膜上皮的方法制作BALB/C小鼠角膜新生血管的动物模型。于造模后3、7、10、14、21和28天,分别处死10只小鼠取全角膜,7片角膜铺片后间接免疫荧光染色,用CD31和Ng2分别标记血管内皮细胞和周细胞,于荧光显微镜或激光共焦显微镜下观察。余角膜组织用于实时RT-PCR检测角膜组织中VEGF,PDGFB和ANGl三种细胞因子mRNA的表达。结果:造模3天（D3）时,周细胞仅出现于新生血管的基底部,顶部血管裸露;至造模后10天（D10）周细胞包裹至血管顶部,但尖端新生血管芽仍然裸露。造模后14—21天（D14—21）,所有血管均见到周细胞。主干血管周细胞呈半球形且排列紧密;分支血管周细胞密度较低,周细胞与周细胞之间有间隙,胞体相对扁平,有伪足样突起,其末梢包绕血管。造模后28天（D28）,周细胞密度进一步下降,出现周细胞与血管分离现象。角膜组织中VEGF,PDGFB和ANGlmRNA的表达上调,于造模后10天达峰值。结论:角膜新生血管形成过程中,周细胞的出现晚于新生血管芽的形成。周细胞密度和形态在主干和分枝血管上存在差异。第二部分VEGF和PDGFB受体酪氨酸激酶抑制剂对生长期角膜新生血管的抑制作用目的:比较在角膜新生血管的生长期,单独或联合使用VEGF及PDGFB受体酪氨酸激酶抑制剂对小鼠角膜新生血管的抑制作用。方法:制作BALB/C小鼠角膜新生血管的动物模型。造模后将小鼠随机分为4组,每组10只。于造模当天腹腔单独注射VEGF、PDGFB受体酪氨酸激酶抑制剂或联合用药,对照为同期小鼠腹腔注射PBS。连续10天后,处死动物取全角膜。7片角膜铺片后间接免疫荧光染色,用CD31和Ng2分别标记血管内皮细胞和周细胞,于荧光显微镜或激光共焦显微镜下观察。余角膜组织用于实时RT-PCR检测VEGF,PDGFB,Angl mRNA的表达。结果:抗VEGF/VEGFR组,角膜新生血管面积占全角膜面积的百分比由同期对照组的34.35%±9.35%下降到18.95%±4.79%（n=7,p＜0.01）。抗PDGF/PDGFR-β组,角膜新生血管面积占全角膜面积的百分比由同期对照组的34.35%±9.35%下降到22.17%±9.7%（n=7,p＜0.05）。联合用药组,角膜新生血管面积占全角膜面积的百分比由同期对照组的34.35%±9.35%下降到17.16%±5.16%（n=7,p＜0.01）。阻断VEGF/VEGFR或PDGFB/PDGFR-β信号转导通路,对VEGF,PDGFB和ANGlmRNA表达的影响没有统计学差异（P＞0.05）。但联合用药时ANGl的mRNA表达下调（P＜0.05）。结论:血管生长期阻断VEGF和PDGF的信号传导,均可以有效抑制小鼠角膜新生血管的形成,但以阻断VEGF/VEGFR信号传导效果更显著。联合用药有增效作用。第三部分VEGF和PDGFB受体酪氨酸激酶抑制剂对稳定期角膜新生血管的抑制作用目的:比较在血管形成的稳定期,单独或联合使用VEGF及PDGFB受体酪氨酸激酶抑制剂对小鼠角膜新生血管的抑制作用。方法:制作BALB/C小鼠角膜新生血管的动物模型。于造模后第10天将小鼠随机分为4组,每组10只。腹腔注射VEGF、PDGFB受体酪氨酸激酶抑制剂或联合用药,对照为同期小鼠腹腔注射PBS。连续10天后,处死动物取全角膜。7片角膜铺片后间接免疫荧光染色,用CD31和Ng2分别标记血管内皮细胞和周细胞,于荧光显微镜或激光共焦显微镜下观察。余角膜组织用于实时RT-PCR检测VEGF,PDGFB,Angl mRNA的表达。结果:抗VEGF/VEGFR组,角膜新生血管面积占全角膜面积的百分比由同期对照组的39.82%±10.13%下降到36.78%±11.93%（n=7,p＞0.05）。抗PDGF/PDGFR-β组,角膜新生血管面积占全角膜面积的百分比由同期对照组的39.82%±10.13%下降到27.23%±10.57%（n=7,p＜0.05）。联合用药组:角膜新生血管面积占全角膜面积的百分比由同期对照组的39.82%±10.13%下降到18.97%±6.62%（n=7,p＜0.01）。阻断PDGF/PDGFR-β信号转导或联合用药,均可显著下调VEGF,PDGFB和ANGlmRNA的表达。结论:阻断VEGF/VEGFR通路,不能有效抑制稳定期新生血管,而阻断PDGF/PDGF-Rβ信号传导,可以造成稳定期新生血管的退缩;联合用药有增效作用。
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