糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白COBL10在花粉管生长和导向过程中的作用机理研究

论文摘要

雄配子体花粉管的生长是完成被子植物授粉和受精等生殖发育过程的一个重要步骤。花粉管导管状的形态源于仅限于细胞表面一个小区域的细胞延伸,又称顶端生长。此外,在雌蕊体内生长的花粉管可以感受雌蕊所发出的信号而改变其生长轴,进行导向性生长。对这种极性及导向性生长的深入了解不但可以为作物的遗传改造奠定理论基础,而且还对于理解细胞信号传导及细胞间的通讯提供重要信息。我们研究的基因,COBL10,一个糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,可能是花粉管极性及导向性生长的关键基因。COBL10基因功能的丧失对于花粉管在体外的生长没有任何影响,但极大地破坏了花粉管在雌蕊体内的生长及导向,导致配子体雄性不育。本研究结合分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物化学等方法,通过研究COBL10在授粉受精过程中的作用机理,揭示其在受精过程中所调控的信号通路。我们的研究发现：（1） COBL10突变后花粉管顶端果胶层的沉积受到了影响,此外花粉管侧翼细胞壁的纤维素沉积降低。（2） COBL10突变对于花粉管壁的影响仅表现在体内生长的花粉管中,暗示COBL10的功能仅表现在有雌蕊引导信号存在的情况下。（3）在体内观察到的突变体花粉管生长迟滞,COBL10定位在顶端质膜及胞内点状细胞器上,这些事实暗示,COBL10可能调控细胞壁的合成或细胞壁构建材料的分泌。（4）突变体花粉管体内生长迟滞暗示COBL10对于雌蕊子房隔膜中分泌的信号分子进行感受和响应。通过对COBL10亚细胞定位及功能域的精细分析,也为植物其他GPI-APs的功能研究提供更多的理论支持。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物花粉与雌蕊的互作
• 1.1.1 花粉与柱头黏附,水合,萌发和识别
• 1.1.1.1 绒毡层细胞参与花粉与柱头识别
• 1.1.1.2 花粉质膜在识别中的作用
• 1.1.1.3 脂类分子参与花粉与柱头的识别
• 1.1.1.4 花粉和柱头的识别诱导柱头组织和花粉中基因转录
• 1.1.1.5 囊泡运输以及磷脂肌醇在花粉与柱头识别过程中可能起到信号作用
• 1.1.1.6 种间花粉—柱头的识别与不亲和互作的分子机制
• 1.1.2 花粉管与雌蕊组织的相互作用及花粉管在雌蕊组织中的生长
• 1.1.2.1 花粉管的生长及其感受雌蕊信号的机理
• 1.1.2.2 微丝骨架调控花粉管生长的分子机理
• 1.1.2.3 S-核酸酶和SLF介导的花粉管生长和抑制的信号转导的分子基础
• 1.1.3 花粉管与胚囊相互作用及雌雄配子体识别
• 1.1.3.1 花粉管与胚囊相互作用的分子遗传机制
• 1.1.3.2 花粉管与胚囊助细胞识别的分子机理
• 1.1.3.3 雌雄配子细胞识别的分子机理
• 1.2 糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白
• 1.2.1 糖基磷酯酰肌醇锚定蛋白的功能
• 1.2.2 雌雄配子的信息交流
• 1.2.3 花粉管的生长
• 1.3 COBRA家族
• 1.3.1 COBRA家族的发现及研究进展
• 1.3.2 COBRA家族成员的蛋白结构
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料的培养与处理
• 2.1.2 质粒及引物
• 2.1.3 酶及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 载体的构建
• 2.2.1.1 植物总RNA的提取（试剂盒法）
• 2.2.1.2 反转录
• 2.2.1.3 拟南芥基因组DNA提取
• 2.2.1.4 PCR扩增
• 2.2.1.5 PCR扩增产物回收（试剂盒法）
• 2.2.1.6 TOPO连接反应
• 2.2.1.7 大肠杆菌转化及质粒提取
• 2.2.1.8 DNA序列测定
• 2.2.1.9 LR反应
• 2.2.1.10 质粒DNA的酶切鉴定
• 2.2.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.2.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化
• 2.2.2.2 拟南芥的栽培及转化
• 2.2.3 花粉管发育及生长表型分析
• 2.2.4 GUS染色分析
• 2.2.5 扫描电子显微镜观察
• 2.2.6 透射电子显微镜观察
• 2.2.7 拟南芥花粉萌发及染色分析
• 2.2.8 拟南芥花粉管的免疫荧光染色
• 2.2.9 激光共聚焦扫描隧道显微镜观察及图像处理
• 2.2.10 化学药剂处理
• 3 结果与分析
• 3.1 cobl10突变体致使雄配子不育
• 3.2 COBL10不影响花粉的发生,水合及萌发
• 3.3 花粉管在COBL10突变体中生长受到影响
• 3.4 花粉管在COBL10突变体中不能导向胚珠
• 3.5 COBL10参与花粉管细胞壁的建成
• 3.6 COBL10的亚细胞定位和功能互补
• 3.7 COBL10的亚细胞定位依赖于它的C端
• 3.8 COBL10在花粉管顶端质膜上的定位依赖于PIG复合体的正常功能
• 3.9 COBL11是COBL10的功能冗余基因
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况