酿酒酵母ARS305两侧序列对其复制活性的影响

论文摘要

DNA复制是细胞的基本功能之一，在生长发育过程中，染色体必须准确无误地复制并分配到下一代细胞中。因此，复制过程受到极其严格的调控，任何失控必将导致严重的后果，包括发育异常、遗传疾病、癌症等。在复制的研究领域，确定真核生物复制起始点或复制子是一个重要方面。酵母是一类低等真核生物，既具有类似原核生物的生长特性，又具有一般真核生物的分子生物学和细胞生物学特性，是作为确定研究复制起始位点或者复制子的一个重要材料。酵母III号染色体是最早完成测序的，也是目前研究的最清楚的。自主复制序列ARS（autonomously replicating sequence）是能有效转化酵母并能在细胞内自主复制的一段DNA序列，在整合到酵母染色体后，能作为酵母的复制起始位点。ARS305是酿酒酵母III号染色体上一个高活性的，使用频率很高的复制子。为了研究其两侧序列对其活性的影响，本文构建了以pRS405为载体，插入不同长度的以ARS305为核心、两侧序列不同的一系列重组质粒；将构建的重组质粒采用PEG/LiAc转化酿酒酵母YPH499感受态细胞。通过测定重组质粒转化率来鉴定ARS305两侧的序列长度对其复制活性的影响。结果表明：ARS305两侧的序列长度越长，其自主复制活性越高。本研究为进一步研究ARS两侧序列形成核小体能力和ARS活性与核小体定位的相关性做出了初步探索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 真核生物的 DNA 复制起始调控
• 1.1.1 真核生物 DNA 复制的特点
• 1.1.2 SV40 DNA 的复制
• 1.1.3 真核细胞 DNA 的复制调控的机制
• 1.2 酿酒酵母的 ARS
• 1.2.1 ARS 概述
• 1.2.2 ARS 的结构
• 1.2.3 酿酒酵母三号染色体上的 ARS
• 1.2.4 ARS305
• 1.3 酵母——大肠杆菌穿梭质粒
• 1.3.1 酵母的 2μm 质粒
• 1.3.2 酵母复制型载体
• 1.3.3 自我复制型载体
• 1.4 酵母的转化
• 1.4.1 原生质体转化法
• 1.4.2 PEG/LiAc 转化法
• 技术路线
• 2 实验材料与方法
• 2.1 酿酒酵母的活化
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 酿酒酵母的活化方法
• 2.2 酵母基因组的提取
• 2.3 酵母 ARS305 不同长度的片段的克隆
• 2.3.1 ARS305-500 的克隆
• 2.3.2 ARS305-1000 的克隆
• 2.3.3 ARS305-2000 的克隆
• 2.3.4 PCR 产物的纯化
• 2.4 大肠杆菌的活化
• 2.4.1 实验材料与试剂
• 2.4.2 大肠杆菌的活化与培养
• 2.5 质粒 pRS405 的小量提取
• 2.6 ARS305 系列片段重组质粒的构建
• 2.6.1 目的片段和载体的双酶切
• 2.6.2 目的片段和载体酶切后的纯化
• 2.6.3 连接反应
• 2.6.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.6.5 重组质粒的酶切鉴定
• 2.6.6 重组质粒的 PCR 鉴定
• 2.7 酵母的转化
• 2.7.1 酿酒酵母生长曲线的测定
• 2.7.2 酿酒酵母转化率的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 酵母基因组的提取
• 3.2 酵母 ARS305 不同长度的片段的克隆
• 3.3 大肠杆菌转化结果
• 3.4 质粒 pRS405 提取及单酶切鉴定结果
• 3.5 重组质粒的鉴定结果
• 3.5.1 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.5.2 重组质粒的 PCR 鉴定
• 3.6 酵母 YPH499 转化率的测定结果
• 3.6.1 酵母 YPH499 生长曲线的测定结果
• 3.6.2 酵母 YPH499 转化率的测定结果
• 3.6.3 重组质粒 pRS-ARS305 系列的转化率结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 在学研究成果
• 致谢