论文摘要
夹竹桃科萝芙木属药用植物蛇根木（Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz）有降血压、抗心律失常、退热、抗癫、治虫蛇咬伤等功效,富含生物碱类化合物,其主要活性成分为阿吗灵、阿吗碱和利血平。对其次生代谢产物生物合成网络的研究是进一步开发利用该药用植物、调控生物代谢方向、体外异源表达活性成分的基础。本论文对催化蛇根木生物碱Perakine还原为Raucaffrinoline反应的Perakine还原酶（Perakine Reductase,PR）进行了一系列的研究,主要包括该酶的表达、生化特征、结晶和三维结构。论文的第一部分对Perakine还原酶的生物化学特征进行了研究。以pQE-2质粒为表达载体,在大肠杆菌M15中异源高效表达N端带有6个组氨酸标记的PR,并利用Ni-NTA亲和层析进行纯化。PR的底物特异性相对较低,在所测试的30个带有可还原性羰基化合物（主要为苯甲醛类衍生物、桂皮醛类衍生物及类单萜吲哚生物碱）中有17个化合物可被PR转化,但PR对类单萜吲哚类生物碱显示了很强的底物特异性。PR特异性地依赖NADPH/NADP+作为辅酶进行氧化还原反应的催化。氨基酸序列比对结果表明,PR为醛酮还原酶（aldo-keto reductase,AKR）超家族的新成员,具有AKR超家族成员高度保守的四个特征性氨基酸Asp52、Tyr57、Lys84、His126,分别定点突变此四个氨基酸,酶活力的丧失均在97.8%以上,证实此四个氨基酸位于活性中心,为催化残基。为进一步深入研究Perakine还原酶的三维结构、活性位点构造及催化机制,论文的第二部分对Perakine还原酶及酶与辅酶/底物复合物进行了结晶条件的摸索及X-ray三维结构的分析。经赖氨酸残基甲基化修饰后,（His）6-PR采用气相扩散悬滴法进行结晶,优化后的结晶条件为:晶体生长温度为20℃,酶的浓度在4.5-5.0 mg/ml之间,以pH 7.0的0.1 M柠檬酸钠为结晶缓冲液,25%PEG4000为沉淀剂。所得甲基化（His）6-PR晶体为正交晶系,属于C2221空间群,晶胞参数为a=58.796（?）,b=93.042（?）,c=142.997（?）,α=β=γ=90°,每个不对称单元中包含一个酶分子。采用分子置换法对甲基化（His）6-PR的三维结构进行了解析,经修正最终PR三维结构模型的R因子和Rfree因子分别为19.0%和24.7%,分辨率为2.30（?）。PR折叠为（α/β）8桶状（TIM桶状）结构。在浸泡法和共结晶都无法获得PR与辅酶/底物复合物的情况下,我们根据PR的X-ray三维结构、活性残基（Asp52、Tyr57、Lys84、His126）的定点突变结果,再结合其他AKR酶与辅酶/复合物三维结构,推测了PR辅酶与底物的结合位点及其催化机制。
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- [3].萝芙木组织培养技术研究进展[J]. 安徽农业科学 2011(15)
- [4].蛇根木根部生物碱积累的组织化学定位研究[J]. 中南林业科技大学学报 2010(09)
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标签：还原酶论文; 醛酮还原酶论文; 功能性表达论文; 吲哚生物碱次生代谢网络论文; 蛇根木夹竹桃科论文; 酶结晶论文; 氧化还原酶三维结构论文;