p38丝裂原活化蛋白激酶在小鼠围植入期子宫内膜及胚胎中的表达及作用

论文摘要

目的:胚胎植入是指在特定的植入窗口期,胚泡附着并侵入子宫内膜的全过程。在这个复杂的过程中,激素、细胞因子、黏附分子、蛋白、肽及酶类等介导了一系列分子生物学事件,在这些因素的精细调控下,某些细胞内信号转导通路被激活,调控特定基因的表达,使胚泡滋养层和子宫内膜发生同步协调变化,从而使得发育正常且具有侵入性的胚泡顺利植入。近年来,尽管关于胚胎植入机理的研究取得了长足的进展,但仍存在许多问题亟待深入探讨。如在植入过程中哪些信号转导通路被激活?激活这些信号转导通路的信号分子来自母体还是来自胚胎、或是两者共同作用?各通路间的关系如何?等等。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK）通路是真核细胞调节增殖、分化、凋亡及细胞间功能同步化的基本信号通路。目前,至少鉴定出了4种MAPK超家族成员,包括细胞外信号调节蛋白激酶（extracellularsignal-regulated kinases,ERK）、p38MAPK、C-jun氨基末端/应激活化蛋白激酶（thec-Jun N-terminal kinase or stress-activated protein kinases,JNK/SAPK）和大丝裂原活化蛋白激酶1（big MAP kinase 1,BMK1/ERK5）通路。这些蛋白及酶构成相互交织的信号级联通路,在细胞内信号传递中起重要作用。近几年国外研究发现,MAPK通路在早期胚胎发育、子宫内膜蜕膜化、胚泡黏附、滋养层细胞增殖以及侵入子宫内膜过程中都起着重要作用。其中p38MAPK信号通路参与了细胞的生长发育及细胞间功能同步等多种生理过程,并与炎症、应激反应的调控密切相关,被认为是细胞信息传递的中枢。最近又有实验显示,p38MAPK在小鼠植入前胚胎中激活,且其激活是子宫内膜蜕膜化过程中所必需的,但国内尚未见这方面的报道。关于围植入期子宫内膜中p38MAPK的表达状况及在体注射p38MAPK特异性抑制剂干扰植入的研究国内外尚未见报道。本实验以妊娠昆明小鼠为动物模型,用免疫组化法检测围植入期胚胎和子宫内膜中p38MAPK的表达及其变化规律;用动物在体宫腔内注射p38MAPK特异性抑制剂和体外胚胎培养技术,观察p38MAPK对早胚发育及植入的影响,从而探讨p38MAPK与胚胎植入的相关关系,以进一步揭示植入的机制,为提高体外受精-胚胎移植（IVF-ET）等辅助生殖技术的成功率以及研究和开发新型抗植入避孕药物提供理论依据和动物模型。研究方法:1.取真孕及假孕1～8天小鼠子宫,石蜡包埋切片,用免疫组化及图象分析法检测围植入期子宫内膜中p38MAPK的表达及变化规律,同时取未孕动情期子宫作为对照组。2.取未经产雌性小鼠常规促排卵,收集2细胞,4细胞,8细胞,桑葚胚,胚泡等不同发育阶段的早胚,用免疫组化及免疫荧光法测定早胚中p38MAPK的表达及变化情况。3.p38MAPK抑制剂干预实验体内实验:取正常妊娠第4天小鼠,剖腹在两侧子宫角处分别注射等剂量的p38MAPK特异性抑制剂和生理盐水,于妊娠第8天颈椎脱臼处死小鼠,检查植入胚胎数。同时取子宫作切片,观察胚胎及子宫内膜的组织学变化。体外实验:取经过PMSG、HCG超排卵后孕2天小鼠,分离输卵管,获取2细胞期胚卵,体外培养。将胚卵随机分为5组,接种到添加不同成分的培养板中培养。组Ⅰ仅含基础培养液（阴性对照）;组Ⅱ含基础培养液和DMSO（溶剂对照）;组Ⅲ、组Ⅳ、组Ⅴ的基础培养液内含不同浓度的p38MAPK特异性抑制剂SB203580,其剂量分别为:0.2μmol/L;2μmol/L;20μmol/L。将培养板置37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱内培养。每12小时观察一次,看其发育情况。48小时后观察其发育到胚泡的情况,用台盼蓝检测胚胎细胞存活率,用免疫荧光法检测各组胚泡中p38MAPK的表达情况。结果:1.在小鼠子宫内膜中,p38MAPK主要表达于腔上皮、腺上皮和蜕膜细胞的胞浆内,偶尔在胞核中。真孕组孕3d,腔上皮中p38MAPK呈阳性表达,孕4～5天呈强阳性表达,此后p38MAPK在腔上皮的表达逐渐减弱;腺上皮中p38MAPK的表达从孕4天开始一直维持在阳性水平,从孕5d开始蜕膜细胞中p38MAPK的表达逐渐增强。假孕组只有孕4天呈弱阳性表达。2.p38MAPK在小鼠胚植入前各细胞期均呈阳性表达,随着妊娠进展,其表达逐渐加强。3.p38MAPK抑制剂干预实验体内实验显示,抑制剂组（10μM）平均胚胎植入数为2.6250±0.5175,明显低于空白对照（7.1250±0.8345）和生理盐水组（6.2500±0.8864）,与两者相比,差异十分显著（P＜0.01）。组织学观察结果:抑制剂组胚胎组织呈退化坏死状态,胚胎周围蜕膜细胞呈明显的空泡样变性,蜕膜及胚胎中均可见大量血细胞浸润。体外实验显示,抑制剂组与对照组胚卵以同样的速率发育到8细胞阶段,但是抑制剂组的胚卵发育却停滞在8-16细胞之间,不能发育到胚泡阶段,比对照组发育晚1-2个细胞期。但抑制剂组胚卵仍具存活能力,将其移入无抑制剂的培养基中,它们仍能发育到胚泡阶段。结论:1.p38MAPK在小鼠植入前胚胎发育过程中起作用。2.p38MAPK参与胚泡植入过程,并可能间接参与植入后的胚泡滋养层扩展、分化及子宫内膜蜕膜化反应。3.p38MAPK在子宫内膜中的表达不仅受母体因素的调控,还可能与胚泡的刺激有关。4.p38MAPK特异性抑制剂可抑制在体小鼠胚泡植入及植入后胚胎和蜕膜细胞的发育。

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