论文摘要
近年来，我国沿海扇贝养殖规模逐渐扩大，扇贝加工量也随之增加。扇贝柱产品在生产和加工过程中，产生了大量低值副产物（包括贝壳、裙边、中肠腺、生殖腺），约占扇贝湿重的70%，尚未得到有效开发利用。扇贝生殖腺蛋白质含量较高，是制备蛋白水解物或活性肽的良好资源。本文以虾夷扇贝生殖腺为研究对象，通过分析雌、雄生殖腺的化学组成，初步研究了中性蛋白酶对雌、雄生殖腺的水解效果及产物功能特性。一方面考察生殖腺水解物的抗氧化活性和理化功能特性，并从水解物中进行抗氧化肽的分离纯化和氨基酸序列鉴定；另一方面，通过美拉德反应修饰和钙螯合修饰制备生殖腺水解物的衍生物，考察其功能特性。主要研究内容及结果如下：（1）化学组成分析表明，虾夷扇贝生殖腺中粗蛋白的质量分数分别达到干重的62.89±0.87%（雌性生殖腺，SFG）和81.66±0.03%（雄性生殖腺，SMG）。将4%底物浓度的变性处理（100℃，10min）和未变性处理（对照组）的虾夷扇贝生殖腺匀浆，利用中性蛋白酶在50℃条件下恒温水解180min后，制备得到虾夷扇贝雌性生殖腺水解物（SFGHs）和雄性生殖腺水解物（SMGHs）。结果表明，SFG经中性蛋白酶水解后，水解效果较好，而中性蛋白酶水解SMG后， SMGHs呈弱凝胶特性。虾夷扇贝雌性生殖腺和雄性生殖腺经变性处理后进行酶解，肽得率和水解度明显高于对照组。与对照组相比，虾夷扇贝雌性生殖腺多肽经变性处理后，肽得率和水解度分别提高了94.78%和36.16%。利用Sephadex G-25凝胶过滤层析对SFGHs进行分离，发现变性处理组的组分较对照组相比更为集中，而且具有一定的还原能力。经高效液相色谱进行分子量分布测定，结果表明变性处理的SFGHs分子量主要分布在250Da～5000Da范围内，约占整个水解液的74.78%，符合生物活性肽的分子量分布范围。因此，对SFG进行热变性处理后，采用中性蛋白酶进行酶解，可以从水解产物中分离纯化得到抗氧化肽组分。（2）针对SMGHs呈弱凝胶性质，制备不同水解度的SMGHs对其理化功能特性进行研究。结果表明，SMGHs的理化功能特性较SMG有所改善。深度水解能提高SMGHs的溶解性和凝胶性，而有限水解后，持水/油性和表面疏水性较好。SMGHs的乳化性与水解度无关，但是受pH环境的制约。SMG的水解导致SMGHs起泡性和泡沫稳定性下降，水解度越大，起泡性和泡沫稳定性越差。氨基酸分析表明，SMG和SMGHs含有丰富的甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，其中必需氨基酸占总氨基酸的41.63%～42.90%，具有较高的营养价值，可作为多功能蛋白基料应用于食品工业中。（3）扫描电镜观察显示，SMGHs呈现多孔、三维网状结构。SMGHs中肽段的分子量主要集中在小于1000Da和大于10000Da的组分，所占比例分别为46.86%和30.30%。采用质构仪研究了SMGHs的凝胶特性，并与几种商品亲水胶体进行比较。结果表明，SMGHs的硬度和稠度分别为40.49±1.96g和479.02±37.04g·sec，和1.5%的瓜尔豆胶和卡拉胶比较接近（p>0.05），并和1.0～2.0%的黄原胶和0.5～1.0%的明胶相当。SMGHs的粘度为23.69±1.92g，接近1.0%的瓜尔豆胶和黄原胶、1.0～1.5%的明胶和1.5%的卡拉胶。SMGHs具有良好的凝胶性质，在某些条件下可替代瓜尔豆胶、明胶、黄原胶和卡拉胶，在食品体系中可能会起到增稠和胶凝作用。（4）为了进一步阐明SMGHs的凝胶机制，通过向SMGHs添加一些能破坏蛋白质分子间作用力的化学试剂，来研究其凝胶性质的变化。结果表明，添加尿素和PG后，SMGHs凝胶强度下降，并且与添加浓度呈正相关。添加8M尿素后，SMGHs凝胶特别弱。添加0.3M的NaCl、KCl、CH3COONa和NaSCN后，SMGH凝胶性质得到显著增强（p<0.05），但是随着添加浓度的增加，SMGHs凝胶性质下降，特别是3M NaSCN对SMGHs凝胶形成的抑制作用。另外，添加DTT、2-ME和NEM也可以降低凝胶性质（p<0.05），但是整体凝胶状态未发生变化。这说明维持SMGHs凝胶形成的分子间作用力主要是疏水相互作用和静电作用。（5）以DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力和还原能力为指标，对SFGHs的抗氧化活性进行了研究。结果表明，SFGHs对DPPH自由基清除能力的IC50值（DPPH自由基清除率达到50%时的样品浓度）为9.44mg/mL，对Fe2+螯合能力的IC50值（螯合率达到50%时的样品浓度）为0.94mg/mL，还原能力的AC0.5值（吸光度为0.5时的样品浓度）为5.88mg/mL。氨基酸分析表明，SFGHs中Gly、Glu、Asp、Val和Lys含量相对较高，其中必需氨基酸占总氨基酸的40.51%。SFGHs经Sephadex G-25凝胶过滤层析分离后得到6个组分，其中4号组分（F4）具有较强的DPPH自由基清除能力。进一步对F4组分进行质谱分析，得到两个寡肽被鉴定为His-Met-Ser-Tyr（P1）和Pro-Glu-Ala-Ser-Tyr（P2）。P1和P2经人工合成后，对DPPH自由基清除能力呈现一定量效关系，其中30mM的P1和P2对DPPH自由基的清除能力分别达到54.03±3.95%和50.27±1.36%，弱于对照BHA（20mM）。另外，P1和P2对羟基自由基诱导的DNA氧化损伤具有较好的保护作用。（6）在SFGHs与还原糖模拟体系下，研究了其美拉德反应产物的抗氧化活性。结果表明，SFGHs美拉德反应的适宜单糖为核糖、反应pH为8.0，肽糖质量比为1:2、适宜反应时间46h、适宜温度80100℃。在此条件下，制备虾夷扇贝雌生殖腺水解物-核糖美拉德反应产物（SFGHs-MRPs），发现SFGHs-MRPs对DPPH自由基清除能力的IC50值为49.55μg/mL，还原能力的AC0.5值为34.34μg/mL，分别是SFGHs的190.51和171.23倍。另外，SFGH-MRPs在浓度为32μg/mL以上时，对羟自由基诱导DNA氧化损伤具有较强的保护能力。SFGHs与核糖美拉德反应过程中，反应体系的pH呈下降趋势，并且温度越高或反应时间越长，pH下降越明显；反应体系的紫外吸收、褐变程度、荧光强度和抗氧化活性呈上升趋势，并且温度越高或反应时间越长，增幅越明显。相关分析表明，虾夷扇贝雌生殖腺水解物-核糖美拉德反应体系pH与OD294、OD420、荧光强度、DPPH自由基清除能力和还原能力均呈现负相关，而其它各指标间表现出显著正相关（p<0.01）。（7）为了优化虾夷扇贝雌性生殖腺多肽-Ca2+螯合物的制备工艺，在单因素试验的基础上，采用响应面二次回归正交旋转组合试验设计，分析了反应pH、时间、温度和多肽/氯化钙质量比对螯合物得率的影响。结果表明，虾夷扇贝雌生殖腺多肽-Ca2+螯合物最优制备工艺为：pH8.0、温度64.8℃、反应时间为22min、多肽与氯化钙质量比为3.4:1，螯合物得率预测值为6.78%，实际得率为6.81%，响应面预测模型较为可靠，可用于指导实际生产。虾夷扇贝雌性生殖腺多肽-Ca2+螯合物中氮和钙质量分数分别为6.67±0.11%和9.75±0.17%。多肽中的氨基和羧基可能参与了Ca2+的螯合反应。虾夷扇贝生殖腺多肽-Ca2+螯合物经体外模拟胃肠道消化后，钙透析率为41.86±2.33%，该螯合物具有较好的钙生物利用度。